大白菜離體再生中LBD基因的作用和春化相關(guān)BrVIN3基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、大白菜作物屬十字花科蕓薹屬作物，通常被認(rèn)為是再生率低和難以遺傳轉(zhuǎn)化的作物。提高離體再生頻率，建立高效離體再生體系是利用基因工程改良大白菜作物的關(guān)鍵。植株再生涉及到胚性愈傷組織產(chǎn)生、體細(xì)胞胚發(fā)生和不定芽/根生長等過程，其中胚性愈傷組織產(chǎn)生是關(guān)鍵的起始環(huán)節(jié)，而LBD是促進(jìn)胚性愈傷組織發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究以37份白菜高代自交系為材料，參照前人的不定芽再生體系并稍作優(yōu)化，對不同材料的不定芽再生頻率進(jìn)行統(tǒng)計，獲得7個再生頻率高的優(yōu)良自交系;

2、繼而選用再生頻率差異大的材料，通過熒光定量PCR測定大白菜愈傷組織發(fā)生過程中LBD基因的表達(dá)模式，初步分析了LBD基因表達(dá)對外植體愈傷組織的產(chǎn)生和再生頻率的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.選用白菜類（大白菜和小白菜）作物子葉再生體系進(jìn)行芽再生頻率統(tǒng)計，結(jié)果表明不同品系材料的不定芽再生率差異巨大，再生率最低為0％，最高可達(dá)到67.2％。
　　2.選用再生率為2.4％的21＃（來源于雜一代品種‘刑都優(yōu)豐’）和55.7％的29#（源

3、于雜一代品種‘夏寶’）自交系為材料，利用熒光定量PCR在愈傷培養(yǎng)的0d、7d、14d、21 d四個時間點檢測白菜LBD基因的表達(dá)。結(jié)果表明，白菜外植體在誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的過程中，LBD基因四個時間點的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;再生頻率不同的材料其LBD基因的表達(dá)量也不同。
　　3.選用4份再生率有明顯差異的自交系材料，進(jìn)一步驗證了上述LBD基因在愈傷組織發(fā)生過程的表達(dá)規(guī)律。并且研究表明外源激素能顯著誘導(dǎo)白菜LBD基因表達(dá)量的增

4、高，有效促進(jìn)材料愈傷組織的形成。
　　在建立的子葉再生體系的基礎(chǔ)上，本研究成功建立大白菜子葉培養(yǎng)農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用本研究組基于全基因組關(guān)聯(lián)分析GWAS(Genome-Wide associationstudy)和傳統(tǒng)QTL(Quantitative trait locus)遺傳定位，在A02染色體上定位了一個與白菜抽薹開花密切相關(guān)的候選基因—BrVIN3(Bra006824)。為驗證Bra006824功能，本研究利用上述篩

5、選獲得的再生頻率高的自交系材料，采用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法將目的基因Bra006824轉(zhuǎn)入相應(yīng)植株中;利用相同的農(nóng)桿菌采用浸花法將基因?qū)霐M南芥并進(jìn)行表型調(diào)查分析，結(jié)果顯示:
　　1.在再生過程中，外植體再生芽對潮霉素的最高耐受濃度是3 mg/L;利用該濃度進(jìn)行抗性芽篩選，初步獲得5株經(jīng)過PCR驗證的轉(zhuǎn)基因植株。
　　2.利用農(nóng)桿菌浸花法將抽薹相關(guān)基因Bra006824導(dǎo)入擬南芥，結(jié)果表明Bra006824基因的異位高表達(dá)可以促進(jìn)