轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在特應(yīng)性皮炎自身變態(tài)反應(yīng)發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　明確自身抗原TGM3參與AD自身變態(tài)反應(yīng)發(fā)病的作用和機(jī)制
　　研究內(nèi)容:
　?、賂GMs的sIgE的水平及與特應(yīng)性皮炎病情相關(guān)性研究;②AD患者皮損表皮中TGM的mRNA和TGM3蛋白的表達(dá);③炎癥刺激下的角質(zhì)形成細(xì)胞的TGM的表達(dá);④TGM3與CD209的體外結(jié)合實驗;⑤TGM3對外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(MDDC)的活化能力研究;⑥TGM3對T細(xì)胞亞群分化的影響。
　　研究方法:

2、　?、俾?lián)合使用免疫捕獲法和生物素標(biāo)記的酶聯(lián)免疫分析法檢測77例AD患者（包括44例青少年及成人、33例嬰兒及兒童）、40例成人尋常性銀屑病和30例成人健康對照者的血清中TGMs的sIgE的表達(dá)，并與病情進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　②用qRT-PCR方法和激光共聚焦顯微鏡檢測AD皮損表皮中的TGM基因mRNA的表達(dá)和TGM3蛋白的表達(dá)。
　?、鄄捎胵RT-PCR方法檢測炎癥刺激狀況下角質(zhì)形成細(xì)胞中TGM的表達(dá)。
　　④聯(lián)用qR

3、T-PCR方法和流式技術(shù)檢測CD209siRNA后CD209的表達(dá)情況。采用ELISA方法和激光共聚焦顯微鏡和流式技術(shù)檢測CD209與TGM3的結(jié)合能力。
　　⑤用流式細(xì)胞儀和CBA小球分別檢測TGM3刺激后的MDDC表面分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表達(dá)情況和細(xì)胞上清中IL-6、IL-1β、IL-8、IL-10、TNF、IL-12p70的表達(dá)。
　　⑥將初始T細(xì)胞與TGM3-MDDC共培養(yǎng)5天，用流式技術(shù)

4、和CBA小球檢測TGM3對T細(xì)胞亞群分化的影響及培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　?、偾嗌倌昙俺扇薃D組、成人尋常性銀屑病組TGMs的sIgE水平均顯著高于成人健康對照組（x2值=37.12和15.88，P值均＜0.001）。內(nèi)源性AD組TGMs sIgE水平比外源性AD組升高(t=2.27，P=0.02)。AD患者組TGMs sIgE水平與患者年

5、齡、病程、SCORAD評分、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、血清總IgE無顯著相關(guān)性(r=0.03，0.14，-0.04,-0.08和0.06,P=0.78,0.24,0.74,0.54和0.62)。
　?、贏D組皮損表皮中TGM3和TGM5的mRNA表達(dá)明顯高于健康對照組(P=0.001和0.01)。AD患者皮損表皮中TGM3蛋白的表達(dá)水平比健康對照表皮明顯升高。
　?、跦aCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入Derp10ug/ml，TSLP20n

6、g/ml刺激12h、24h、36h后，TGM1表達(dá)均比空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）。加入IL-1β10ng/ml和50ng/ml刺激24h后，TGM1的表達(dá)比空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.001）。在Derp10ug/ml刺激12h、36h后，TSLP50ng/ml刺激24h和TSLP20ng/ml刺激36h后，IL-1β50ng/ml刺激24h后，TGM2的表達(dá)均比空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意

7、義（P均＜0.01）。在TSLP20ng/ml刺激12h后，Derp10ug/ml刺激24h和36h后，TSLP50ng/ml或IL-1β50ng/ml刺激24h后，TGM3的表達(dá)均比空白對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。在derp10ug/ml刺激24h、36h，TSLP50ng/ml、IL-1β50ng/mL刺激24h，TSLP20ng/ml刺激36h后，TGM5的表達(dá)均比對照組的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0

8、.001)。
　?、蹸D209siRNA轉(zhuǎn)染24小時后，CD209mRNA表達(dá)開始下降，CD209蛋白表達(dá)在72h時下降最明顯。ELISA結(jié)果顯示CD209可以與TGM3結(jié)合，激光共聚焦顯微鏡下及流式細(xì)胞儀檢測顯示TGM3可以被293T及MDDCs細(xì)胞上的CD209識別并結(jié)合攝取入細(xì)胞內(nèi)，其結(jié)合能力可以被CD209阻斷抗體及CD209siRNA部分阻斷。
　?、軹GM3刺激24h后，MDDCs上的CD83、CD86分子及培養(yǎng)

9、上清中炎癥因子IL-6的表達(dá)水平與空白組、CD209抗體封閉組(α-CD209)比較有顯著差異(CD83:P＜0.001;CD86:P=0.007;IL-6:P=0.006)。
　?、夼c空白組比較，TGM3—MDDCs-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組的IFN-γ的表達(dá)升高，表達(dá)比率和MFI值均升高。與空白組比較，TGM3—MDDCs-T細(xì)胞混合培養(yǎng)組的TNF-α，IFN-γ分泌增加，差異有顯著性(P=0.0018)。
　　研究結(jié)論:

10、>　?、貯D患者血清中TGMs sIgE水平明顯升高，TGMs可能是AD患者的一種內(nèi)源性自身抗原。
　?、贏D患者皮損中TGM3的mRNA和蛋白表達(dá)均升高。
　?、墼谝欢ǖ臐舛菵erp、TSLP、IL-1β刺激下，HaCat細(xì)胞的TGM1、TGM2、TGM3、TGM5基因的表達(dá)均有不同程度的升高。
　?、蹸D209siRNA可有效降低CD209的mRNA和蛋白的表達(dá)。TGM3被CD209識別結(jié)合，并被介導(dǎo)攝取進(jìn)入MDD