轉谷氨酰胺酶催化花生過敏原Ara h 2反應體系的研究.pdf

1、花生是世界糧農組織認證的八大食物過敏原之一，花生可導致嚴重的過敏反應，甚至危及生命，且一般不隨年齡的增長而消失。隨著人們生活水平的提高，食物過敏的問題越來越受到關注，因此也越來越多的研究致力于降低花生過敏原的致敏能力。本文以花生中主要過敏原Ara h2為研究對象，由于Ara h2是花生蛋白中重要的過敏原，因此降低Ara h2的致敏性有重要的實際意義。
　　本研究對微生物轉谷氨酰胺酶（microbal transglutaminas

2、e，MTGase）與Ara h2蛋白的反應體系中，不同條件對反應體系的影響進行了探究，分析了酶催化產物結構的變化，評估了加工后Ara h2消化性及其潛在致敏性的變化。研究還將還原蛋白的交聯(lián)產物進行分離，得到低聚物及高聚物，分析了它們的結構及性質的區(qū)別。研究的主要方法、結果及結論如下：
　　1.MTGase催化還原Ara h2產物在SDS-PAGE電泳上有大分子聚合物產生，說明蛋白發(fā)生了外交聯(lián)反應，另外與天然Ara h2相比，酶催化

3、反應后Ara h2單體條帶發(fā)生下移，顯示蛋白的結構變得更加緊湊，平均粒徑減小，質譜鑒定證實 Ara h2發(fā)生了內交聯(lián)反應。體系中還有脫酰胺反應發(fā)生，研究測定了MTGase催化的還前后蛋白溶液pH值的變化，發(fā)現(xiàn)溶液pH都升高，這是由于氨基脫落造成的。不論還原前后，每分子Ara h2脫落游離氨的個數(shù)均大于2，證明體系中都有脫酰胺反應發(fā)生。因此，酶催化還原蛋白發(fā)生了三種反應，即：外交聯(lián)反應，內交聯(lián)反應，脫酰胺反應，而酶直接催化Ara h2則僅

4、發(fā)生了內交聯(lián)和脫酰胺反應，未發(fā)現(xiàn)外交聯(lián)。
　　2.研究了蛋白濃度、反應溫度及還原程度對MTGase催化Ara h2反應體系的影響。對于MTGase催化還原Ara h2的體系，蛋白濃度較高時有利于發(fā)生外交聯(lián)反應，低濃度有利于發(fā)生內交聯(lián)反應；還原則更有利于暴露谷氨酰胺殘基，有利于蛋白發(fā)生脫酰胺作用。對于MTGase催化天然Ara h2的體系，反應不受蛋白濃度的影響，而脫酰胺作用隨著溫度的增加而增強。
　　3.利用質譜結合軟件的方

5、法，確定了內交聯(lián)的交聯(lián)位點，并利用圓二色譜，紫外光譜及熒光光譜檢測了酶催化反應后Ara h2二三級結構及表面疏水性的變化。酶催化天然蛋白只找到1對交聯(lián)片段，而還原蛋白有18對交聯(lián)片段，5個交聯(lián)位點，其中13個片段都包含了過敏原表位，4個交聯(lián)位點都在過敏原表位中，且涉及到的過敏原表位包含了Ara h210個線性表位中的5個。酶催化的天然蛋白結構變化不明顯，而還原可以打開蛋白結構，破壞α-螺旋結構，α-螺旋結構減少，同時β-折疊和無規(guī)則卷曲

6、結構增多。還原蛋白交聯(lián)產物中低聚物α-螺旋含量高于聚物，且紫外吸收低于高聚物，表面疏水性高于高聚物，表明低聚物蛋白有更緊密的結構。
　　4.采用體外模擬胃腸消化的方法分析了MTGase催化對Ara h2消化性的影響。天然Ara h2耐胃消化，但經過胃消化后再經腸消化，Ara h2可以被消化，在消化80min時仍有部分13kDa的片段存在。酶直接處理不改變Ara h2的胃腸消化特性，而還原和交聯(lián)處理則可以加快Ara h2的消化速率，

7、還原及交聯(lián)產物在經過胃腸消化后，都可以全部被消化為小于3.5kDa的片段。且交聯(lián)產物中高聚物的消化速率高于低聚物的消化速率，這主要是由于低聚物中內交聯(lián)蛋白的緊密結構可以降低交聯(lián)產物的消化速率。
　　5.采用競爭抑制ELISA法檢測MTGase催化對Ara h2抗原性及潛在致敏性的影響。酶直接處理基本不改變Ara h2的IgG結合能力，還原處理可以降低IgG結合能力，但是不顯著，而還原后再交聯(lián)則可以降低Ara h2的IgG結合能力，