有機(jī)磷農(nóng)藥中毒生物標(biāo)志物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　1.采用基于質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白組學(xué)方法研究有機(jī)磷農(nóng)藥白蛋白加合物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)規(guī)律，確定有機(jī)磷農(nóng)藥生前入體和死后染毒的鑒別標(biāo)志物；
　　2.采用代謝組學(xué)方法篩選并確定有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)潛在生物標(biāo)志物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)規(guī)律進(jìn)行研究，確定有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的代謝組學(xué)生物標(biāo)志物，為相關(guān)案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.烷基膦?；野彼岬暮铣?br>　　采用羧基和氨基端有保護(hù)基的

2、N-芐氧羰基-L-酪氨酸與芐基溴反應(yīng)生成N-芐氧羰基-L-酪氨酸苯酯，再與相應(yīng)結(jié)構(gòu)的烷基磷酰氯反應(yīng)生成N-芐氧羰基-O-(O-二烷基膦酰基)酪氨酸苯酯，最后脫去酪氨酸在羧基和氨基端的保護(hù)基，生成烷基膦?；野彼?。
　　2.有機(jī)磷農(nóng)藥白蛋白加合物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)
　　分別對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒、慢性中毒和死后染毒大鼠血液進(jìn)行白蛋白加合物分析，對(duì)空白血液室溫放置不同時(shí)間與有機(jī)磷農(nóng)藥在37℃水浴中孵育24小時(shí)后檢測(cè)白蛋白加合物，觀察

3、有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒大鼠白蛋白加合物在室溫，4℃，-20℃和添加1％NaF室溫保存條件下血液中穩(wěn)定性的穩(wěn)定性規(guī)律，對(duì)中毒案例血液中白蛋白加合物進(jìn)行分析，驗(yàn)證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
　　3.代謝組學(xué)篩選確定潛在中毒生物標(biāo)志物
　　分別對(duì)毒死蜱，敵敵畏，甲胺磷，氧化樂(lè)果，甲拌磷和對(duì)硫磷急性中毒大鼠與空白對(duì)照樣本的代謝物質(zhì)譜圖信息進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，PCA分析，PLS-DA分析，差異化合物篩選，差異化合物鑒定等分析，得到其代謝指紋圖，進(jìn)一步對(duì)

4、潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析并在代謝水平上闡述有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒的毒理學(xué)機(jī)制。
　　4.潛在中毒生物標(biāo)志物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)
　　選用在精氨酸和脯氨酸代謝通路上的主要代謝物肌酸及其上游代謝物乙酸胍，甘油磷脂代謝通路中上下游的代謝物L(fēng)-α-磷脂酰膽堿和L-α-甘油磷酸膽堿，二硫代磷酸二乙酯，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法對(duì)毒死蜱，敵敵畏，甲胺磷，氧化樂(lè)果，甲拌磷和對(duì)硫磷急性中毒大鼠和對(duì)照組大鼠血液中乙酸胍、肌酸、磷脂酰膽堿、甘

5、油磷酸膽堿和二硫代磷酸二乙酯的含量進(jìn)行分析檢測(cè)，確定有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒的代謝生物標(biāo)志物。
　　結(jié)果：
　　1.烷基膦?；野彼岬暮铣?br>　　烷基膦酰基酪氨酸的合成純度較高，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析二乙基膦酰酪氨酸分子量為317.1，質(zhì)子化后MH+為主要離子，產(chǎn)物離子主要為272.1，244.0和216.0。二甲基膦酰酪氨酸分子量為290.2，質(zhì)子化后MH+為主要離子，產(chǎn)物離子主要為228.2。二乙基硫代膦酰酪氨酸分子量為333.3，

6、質(zhì)子化后MH+為主要離子，產(chǎn)物離子主要為187.2，217.1，245.1和120.2，以上產(chǎn)物均可用于有機(jī)磷農(nóng)藥白蛋白加合物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究。
　　2.有機(jī)磷農(nóng)藥白蛋白加合物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)
　　敵敵畏急性中毒致死組，慢性中毒組，混合中毒實(shí)驗(yàn)組均檢出二甲基膦酰酪氨酸；死后染毒，空白血液室溫放置不同時(shí)間與敵敵畏在37℃水浴中孵育24小時(shí)的實(shí)驗(yàn)組中中毒案例血液放置六個(gè)月后均未檢出二甲基膦酰酪氨酸；敵敵畏與白蛋白的加合物含量

7、較低且不穩(wěn)定，添加1%NaF會(huì)加速其降解，常溫和4℃保存12天大部分已經(jīng)降解，-20℃保存可以延緩其降解；
　　毒死蜱，甲拌磷和對(duì)硫磷急性中毒致死組，慢性中毒組，混合中毒組，大鼠死后0.5小時(shí)給藥，空白血液室溫放置不同時(shí)間與有機(jī)磷農(nóng)藥在37℃水浴中孵育24小時(shí)的實(shí)驗(yàn)組和中毒案例血液放置三個(gè)月均檢出二乙基硫代膦酰酪氨酸；大鼠死后1小時(shí)染毒，血液中未檢出二乙基硫代膦酰酪氨酸；毒死蜱，甲拌磷和對(duì)硫磷與白蛋白的加合物含量較高，-20℃保存

8、條件下比4℃保存條件下較穩(wěn)定，常溫保存和添加1%NaF會(huì)加速其降解。
　　3.代謝組學(xué)篩選確定潛在中毒生物標(biāo)志物
　　通過(guò)代謝組學(xué)的研究方法篩選和確定出18種潛在的生物標(biāo)志物，得到其代謝指紋圖。其中，硬脂酰胺，辛胺，N,N-二甲基苯胺，神經(jīng)酰胺，二乙基硫代磷酸，丙酮酸，葡萄糖酸在急性中毒的作用明顯。與對(duì)照組比較，神經(jīng)酰胺的濃度均降低，葡萄糖酸的濃度均升高；除甲胺磷中毒實(shí)驗(yàn)組外，二乙基硫代磷酸的濃度均升高；對(duì)硫磷中毒實(shí)驗(yàn)組外，

9、N,N-二甲基苯胺的濃度變化均有意義。
　　進(jìn)一步對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行代謝通路分析得到11個(gè)代謝產(chǎn)物主要參與了包含三羧酸循環(huán)，丁酸甲酯代謝，氨基酸的生物合成和代謝，丙酮酸的代謝，糖酵解和糖異生，脂肪酸的合成、延長(zhǎng)和代謝，嘌呤代謝等相關(guān)通路在內(nèi)的16條代謝通路的過(guò)程，二乙基硫代磷酸為OPs入體的一個(gè)重要標(biāo)志物，丙酮酸和琥珀酸與能量代謝障礙有關(guān)，神經(jīng)酰胺，磷脂酰膽堿和溶血卵磷脂與細(xì)胞凋亡有關(guān)，尿酸，葡萄糖酸與腎臟損害有關(guān)，乙酰肉堿與神

10、經(jīng)系統(tǒng)損害有關(guān)，從而在代謝水平上闡述有機(jī)磷農(nóng)藥急性中毒的毒理學(xué)機(jī)制。
　　4.中毒生物標(biāo)志物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)
　　二硫代磷酸酯可以作為甲拌磷中毒的生物標(biāo)志物之一；中毒實(shí)驗(yàn)組血液中肌酸含量均升高，乙酸胍含量明顯降低；與急性中毒實(shí)驗(yàn)組相比，死后1/2小時(shí)和死后1小時(shí)灌藥染毒，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血液中肌酸濃度均下降。
　　急性O(shè)Ps中毒后，死后1/2小時(shí)和死后1小時(shí)灌藥染毒實(shí)驗(yàn)組甘油磷酸膽堿含量與空白組相比保持不變，甘油磷酸膽堿的

11、濃度與死亡時(shí)間無(wú)關(guān)系。與急性中毒實(shí)驗(yàn)組比較，死后1/2小時(shí)和死后1小時(shí)灌藥各實(shí)驗(yàn)組磷脂酰膽堿的濃度均下降。
　　結(jié)論：
　　1.烷基膦酰基酪氨酸的化學(xué)合成方法可以作為 OPs-白蛋白加合物法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)規(guī)律研究的對(duì)照品；血漿代謝物的LC-Q-TOF-MS分析方法，OPs-白蛋白加合物的LC-MS-MS分析方法可以用于OPs中毒生物標(biāo)志物的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究；
　　2.二甲基膦酰酪氨酸可以作為敵敵畏生前入體和死后染毒鑒別

12、的生物標(biāo)志物，但其穩(wěn)定性較差，檢測(cè)時(shí)限較短；二乙基硫代膦酰酪氨酸可以作為OPs入體的生物標(biāo)志物，但無(wú)法對(duì)甲拌磷、對(duì)硫磷及毒死蜱生前入體和死后染毒進(jìn)行鑒別；
　　3.由OPs急性中毒的代謝指紋圖可得到18種潛在的生物標(biāo)志物，其中11個(gè)代謝產(chǎn)物主要參與了體內(nèi)16條代謝通路的生物學(xué)過(guò)程，導(dǎo)致能量代謝障礙，特別是三羧酸循環(huán)的障礙，在細(xì)胞凋亡，脂肪酸代謝和中毒反應(yīng)之間存在著劑量依賴的關(guān)系，并導(dǎo)致肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂；