基于PAR-2-MLCK-ZO-1信號(hào)通路研究防風(fēng)保護(hù)腸粘膜屏障的機(jī)制.pdf

1、背景：
　　腸粘膜機(jī)械屏障損傷（Intestinal Barrier Dysfunction）是感染后腸易激綜合征（PI-IBS）重要的發(fā)病機(jī)制之一。痛瀉要方是治療IBS的重要方劑，目前痛瀉要方對(duì) IBS腸粘膜屏障損傷的作用研究國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道。防風(fēng)是痛瀉要方的組成之一，古籍醫(yī)書(shū)有―御風(fēng)如屏障‖等相關(guān)的論述，現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)防風(fēng)具有抗腸粘膜損傷的作用。防風(fēng)不僅具有祛內(nèi)外之風(fēng)的功效，而且還應(yīng)具有防御風(fēng)邪之屏障作用，但其―御風(fēng)如屏障

2、‖的功效目前尚未引起人們的充分重視，機(jī)理亦未得到深入闡明。
　　目的：
　　通過(guò)研究防風(fēng)對(duì)PI-IBS大鼠腸粘膜機(jī)械屏障的影響及對(duì)Caco-2細(xì)胞屏障模型的作用，獲得防風(fēng)保護(hù)腸機(jī)械屏障的證據(jù)。并從PAR-2/ MLCK/ ZO-1信號(hào)通路介導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞屏障損傷探討防風(fēng)保護(hù)腸屏障的分子機(jī)制，為闡釋防風(fēng)“御風(fēng)如屏障”的科學(xué)內(nèi)涵，為揭示其保護(hù)腸屏障的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、建立彎曲桿菌灌胃誘導(dǎo)的

3、PI-IBS大鼠模型，給以三個(gè)劑量的防風(fēng)治療14天，測(cè)量大鼠的內(nèi)臟疼痛的壓力閾值和24 h內(nèi)稀便次數(shù)評(píng)價(jià)給藥對(duì)大鼠PI-IBS的治療作用。透射電鏡技術(shù)觀察防風(fēng)對(duì)大鼠腸機(jī)械屏障的超微結(jié)構(gòu)的影響，評(píng)價(jià)防風(fēng)保護(hù)腸機(jī)械屏障的效應(yīng)。
　　2、建立 Caco-2細(xì)胞腸機(jī)械屏障損傷模型，MTT法確定防風(fēng)的給藥劑量。給以三個(gè)劑量的防風(fēng)提取物，測(cè)定防風(fēng)對(duì)細(xì)胞跨膜電阻（TEER值）和熒光黃透過(guò)率（PFP值）的影響，并分別應(yīng)用RT-PCR和wester

4、n blot技術(shù)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞PAR-2和MLCK mRNA基因及細(xì)胞緊密連接ZO-1蛋白的表達(dá)；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞緊密連接ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、與模型組相比，防風(fēng)高中低劑量給藥治療組大鼠的內(nèi)臟疼痛（抬腹和拱背）壓力閾值顯著升高、24 h內(nèi)稀便次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；3個(gè)劑量防風(fēng)可不同程度改善 PI-IBS大鼠腸上皮機(jī)械屏障損傷，腸上皮細(xì)胞內(nèi)腔面絨毛結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整

5、濃密狀態(tài)，腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)也恢復(fù)致密，且橋粒結(jié)構(gòu)完整，密度恢復(fù)。
　　2、MTT法確定防風(fēng)對(duì)Caco-2細(xì)胞的安全給藥范圍，設(shè)定30、60和120μg/ml為防風(fēng)低中高三個(gè)劑量組；防風(fēng)可顯著提高類蛋白酶誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞損傷屏障模型的TEER值和PPT值（P＜0.05），抑制PAR-2和MLCK的mRNA表達(dá)（P＜0.05）升高ZO-1與Occludin緊密連接蛋白表達(dá)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　防