姜黃素紅曲霉菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗腫瘤作用的研究.pdf

1、目的：利用紫紅紅曲霉菌對(duì)姜黃素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，研究轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)腫瘤的抑制作用及其可能機(jī)理，為進(jìn)一步篩選新型高效的姜黃素類抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）從紅曲米中分離紅曲霉菌，研究其產(chǎn)色素、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、酯解酶的能力，分析其用于姜黃素生物轉(zhuǎn)化的可行性。
　　（2）將活化的紅曲霉菌以10％接種到含1%姜黃素的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，后轉(zhuǎn)至28℃培養(yǎng)12h，再30℃恒溫培養(yǎng)7d進(jìn)行姜黃素生物轉(zhuǎn)

2、化；不加姜黃素的紅曲霉菌培養(yǎng)物為菌體對(duì)照；培養(yǎng)基中加入1%姜黃素但不接種紅曲霉菌作為底物對(duì)照。乙酸乙酯提取后，薄層層析（展開(kāi)劑為氯仿：甲醇：甲酸=96：2：0.1）對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。
　　（3）研究轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力。
　?。?）昆明種小鼠腋下接種1×107個(gè)小鼠H22肝癌細(xì)胞，即刻給予治療：姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）；底物對(duì)照

3、組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）的底物；菌體對(duì)照組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）；環(huán)磷酰胺對(duì)照組（200mg/kg·d）；模型組和正常組給予0.9%NaCl0.5ml。常規(guī)飼養(yǎng)、治療，10d后禁食12h，摘眼球取血，脫頸處死，剝?nèi)∧[瘤、稱重，計(jì)算抑瘤率；取肝臟、胸腺、脾臟稱重，計(jì)算臟器指數(shù)；分離血清，測(cè)定MDA、SOD、GSH-P

4、X、TNF-α、IL-2；取肝臟勻漿后，測(cè)定MDA、SOD、GSH-PX。
　　結(jié)果：
　　（1）本文分離獲得的紅曲霉菌，能產(chǎn)生色素，具有糖化淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、酯解酶活性，可以用于姜黃素的轉(zhuǎn)化研究。
　?。?）利用該菌對(duì)姜黃素進(jìn)行固體發(fā)酵微生物轉(zhuǎn)化，乙酸乙酯提取培養(yǎng)物，TLC結(jié)果顯示紅曲霉菌和姜黃素共培養(yǎng)物出現(xiàn)了能產(chǎn)生熒光的新斑點(diǎn)，比移值分別為0.133和0.192，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的比移值為0.367。未加菌的姜黃

5、素培養(yǎng)物與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品展開(kāi)斑點(diǎn)基本一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)化過(guò)程不存在非微生物引起的藥物分解產(chǎn)物。將紅曲菌培養(yǎng)物與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品在同一點(diǎn)點(diǎn)樣，展開(kāi)后，沒(méi)有上述產(chǎn)熒光的斑點(diǎn)，說(shuō)明新斑點(diǎn)并非在TLC展開(kāi)過(guò)程中由于紅曲菌培養(yǎng)物和姜黃素互相干擾遷移而形成的。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物在10000-400μg/ml(相當(dāng)于含姜黃素100-4μg/ml)濃度范圍內(nèi)有很強(qiáng)的自由基清除能力，100μg/ml（相當(dāng)于含姜黃素1μg/ml）還保留了47.46%的

6、清除能力；而底物對(duì)照物在10000μg/ml（相當(dāng)于含姜黃素100μg/ml）、2000μg/ml（含姜黃素20μg/ml）時(shí)有一定的清除能力，但400μg/ml（含姜黃素4μg/ml）濃度時(shí)自由基清除能力已明顯減弱，100μg/ml（含姜黃素1μg/ml）以下已基本消失。
　　（4）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組的抑瘤作用分別為：37.08%、48.91%、26.55%，明顯高于同劑量的菌體對(duì)照組（6.39%、5.76%、5.2

7、9%）和底物對(duì)照組（19.57%、16.11%、11.61%）。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的各劑量組的抑瘤作用并沒(méi)有環(huán)磷酰胺對(duì)照組的強(qiáng)。
　?。?）小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各劑量組均高于腫瘤模型組，而菌體對(duì)照組、底物對(duì)照組則與腫瘤模型組比較沒(méi)有明顯差異（p>0.05）。說(shuō)明姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組能夠提高機(jī)體主要免疫器官的臟器指數(shù)，而菌體對(duì)照及底物對(duì)照的作用則不明顯。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清TNF

8、-α（106.04±12.10pg/ml、97.25±18.21pg/ml、88.13±6.95pg/ml）、IL-2水平（19.47±2.90pg/ml、17.94±2.28pg/ml、14.87±2.65pg/ml）均高于腫瘤模型組，其與菌體對(duì)照組（TNF-α：74.40±8.70pg/ml、IL-2：11.79±1.83pg/ml）、底物對(duì)照組（TNF-α：72.86±14.37pg/ml、IL-2：11.85±2.47pg/ml

9、）比較，均高于菌體對(duì)照組及底物對(duì)照組，有明顯的差異（p<0.05）。說(shuō)明姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能是通過(guò)提高體內(nèi)TNF-α水平來(lái)直接殺傷腫瘤或者提高IL-2水平增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清MDA含量分別為：2.81±0.65nmol/ml、3.75±1.62nmol/ml、4.75±1.62nmol/ml，肝臟MDA含量分別為：1.20±0.30nmol/ml、1.08±0.36nmo

10、l/ml、1.20±0.34nmol/ml，與腫瘤模型組比較，其血清和肝臟的過(guò)氧化脂質(zhì)的含量顯著降低（p<0.05）；而菌體對(duì)照組和底物對(duì)照各劑量組作用則不明顯（p>0.05）。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清中超氧化物歧化酶的含量分別為：19.26±1.01U/ml、19.51±0.47U/ml、18.63±1.10U/ml，肝臟中分別為：21.33±0.36U/ml、21.21±0.78U/ml、21.77±0.

11、38U/ml。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的含量分別為：59.32±2.50U/L、59.18±5.18U/L l、56.90±6.29U/L，肝臟中的分別為：55.32±2.50U/L、55.18±3.26U/L、56.20±2.29U/L。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各劑量組血清、肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的含量低于正常組，與腫瘤模型組、菌體對(duì)照組、底物對(duì)照組比較沒(méi)有差異（p>0.05）。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)此

12、二酶作用不明顯，說(shuō)明其抗氧化作用可能并非通過(guò)改變此二酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　?。?）紫紅紅曲霉菌能產(chǎn)生多種酶系，是理想的生物轉(zhuǎn)化體系，利用該菌轉(zhuǎn)化姜黃素，可形成極性降低的新化合物群。
　　（2）體外實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素新組合型天然化合物群具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。
　?。?）體內(nèi)試驗(yàn)顯示姜黃素新組合型天然化合物群對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤有明顯的抑制作用。
　　（4）能夠增加機(jī)體主要免疫器官的臟器指數(shù)，提高