UGT1A1基因多態(tài)性檢測室間質量評價及基于CRISPR-Cas9系統的EML4-ALK融合基因檢測的研究.pdf

1、伊立替康是廣泛用于治療晚期結直腸癌等惡性腫瘤的化療藥，然而其治療存在較大毒性，常發(fā)生遲發(fā)性腹瀉及嚴重中性粒細胞減少癥。研究表明個體UGT1A1基因多態(tài)性狀態(tài)與伊立替康治療不良反應密切相關。為優(yōu)化臨床伊立替康藥物療效的管理，國內越來越多的實驗室開展了UGT1A1基因多態(tài)性檢測。室間質量評價是UGT1A1基因多態(tài)性檢測質量保證的重要內容。在本研究之前，中國UGT1A1基因多態(tài)性分型的室間質量評價尚為空白。為了提高臨床實驗室UGT1A1基因分

2、型能力，本研究第一部分中以可模擬真實臨床樣本的UGT1A1基因多態(tài)性細胞系為質控品，將其用于實驗室基因多態(tài)性檢測室間質量評價，探討該質控品的實用性和各臨床實驗室UGT1A1基因多態(tài)性分型能力。
　　制備的細胞質評樣本由3種不同UGT1A1基因多態(tài)性的永生化人淋巴細胞系組成。首先對制備的細胞質評樣本性能進行了驗證分析，其穩(wěn)定性及均一性符合室間質評樣本的要求。采用PCR-Sanger測序法對不同基因型進行驗證，結果與預期相符。隨后將制

3、備的該質評樣本組成包括10支樣本的室間質評樣本盤，發(fā)放至全國45家臨床實驗室。共收到45份有效回報結果，檢測結果完全正確實驗室為97.7％(44/45);所有參評實驗室檢測的樣本符合率為99.4％，僅一份假陰性結果，無假陽性結果;使用最多的檢測方法是PCR-測序法(75.6％，34/45)，其中24份結果采用PCR-焦磷酸測序法檢測。本研究第一部分成功運用含UGT1A1多態(tài)性的細胞樣本進行全國室間質評，細胞樣本較臨床標本來源更穩(wěn)定，異質

4、性小，容易大量制備，可有效用于UGT1A1多態(tài)性基因分型檢測室間質量評價。本次室間質量評價的結果表明，國內大多數UGT1A1基因分型實驗室具備正確分型UGT1A1基因多態(tài)性的能力。
　　非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的EML4-ALK融合基因是化療藥物ALK激酶抑制劑—克唑替尼的分子靶標，而選擇克唑替尼治療的前提為準確和可靠地檢測出ALK基因重排。目前熒光原位雜交(fluores

5、cence in situhybridization，FISH)是臨床EML4-ALK融合基因檢測驗證的標準方法，但存在價格昂貴，操作規(guī)范要求較高，檢測周期長等缺點，因此EML4-ALK融合基因的檢測方法仍有待改進。
　　本研究第二部分的目的是以CRISPR-Cas9(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated

6、 easpase9(Cas9))技術平臺為基礎，利用核酸酶失活的Cas9(nuelease-deficient Cas9，dCas9)與sgRNA(singleguide RNA)組裝后具有與靶序列結合而不對其切割的特點，將熒光標記的dCas9蛋白與靶向ALK基因的sgRNA分子體外組裝為核酸探針，建立針對EML4-ALK基因重排檢測的新方法，首次探討該技術在臨床分子診斷中的應用價值。本研究中，通過原核表達純化dCas9蛋白，其中dCa

7、s9蛋白融合表達Halo標簽，可采用多種Halo熒光配基實現對dCas9蛋白不同熒光標記。首先以端粒重復序列的檢測對sgRNA/dCas9檢測體系進行了驗證及優(yōu)化。通過設計端粒sgRNA，體外與dCas9蛋白組裝后檢測本研究中所用細胞系的端粒，結果顯示端粒-sgRNA/dCas9復合物可成功檢測體外固定細胞中染色體端粒。隨后，以含串聯重復序列的MUC4基因2號外顯子及相鄰3號內含子為靶點設計sgRNA，與兩種不同熒光標記的dCas9蛋白

8、分別組裝，進一步驗證了該方法進行雙基因標記的能力。利用該檢測體系對非小細胞肺癌EML4-ALK融合基因進行了檢測。本研究中ALK為單拷貝基因，為提高熒光檢測靈敏度，對ALK基因重排位點上下游各約5kb特異靶序列分別設計多條sgRNAs，組裝兩種熒光標記的dCas9蛋白后分別對肺癌EML4-ALK陽性細胞系及陰性細胞系進行ALK基因重排檢測。初步結果顯示，由于該檢測體系加入多條sgRNA序列，熒光標記信噪比較重復序列檢測低，結果觀察不明顯

9、;對于EML4-ALK陽性的細胞系，可在少數細胞中觀察到分離熒光信號的陽性結果;對于EML4-ALK陰性的對照細胞系，熒光重合點較預期結果少，需進一步優(yōu)化檢測條件。綜上所述，基于CRISPR/dCas9系統的體外基因檢測方法操作簡便，省時，具有良好的應用前景。首次通過該檢測方法初步探討了其對非小細胞肺癌ALK基因重排的檢測，結果顯示該方法對ALK基因重排具有一定的檢測能力，但仍需對方法學進行優(yōu)化后進一步驗證。
　　本研究的創(chuàng)新點主