2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、胞內(nèi)體蛋白分選是泛素調(diào)控內(nèi)吞作用中的關(guān)鍵步驟,泛素標(biāo)記的蛋白被胞內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(ESCRT)識(shí)別后,分選進(jìn)入溶酶體途徑進(jìn)行降解。泛素是胞內(nèi)體蛋白分選和降解調(diào)控中重要的信號(hào),可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞的蛋白從胞內(nèi)體通過MVB進(jìn)入溶酶體的降解途徑。Tom1L1也可以與泛素結(jié)合。PR-619是一種可逆的(DUBs)的抑制劑,可以延長(zhǎng)Ubiquitin信號(hào),而ESCRT復(fù)合物蛋白的Hrs和TSG101在泛素化蛋白分選過程中也起著重要作用。
  

2、目的:
  泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Ub-TfR)融合蛋白由于有泛素的標(biāo)記,使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在胞內(nèi)體上被分選進(jìn)入多泡體/溶酶體的降解途徑,不是沿著轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通路再循環(huán)內(nèi)體回到細(xì)胞質(zhì)膜的經(jīng)典途徑,在研究胞內(nèi)體蛋白分選途徑過程的共同機(jī)制中,成為了一個(gè)非常理想的標(biāo)記。所以泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)質(zhì)粒的成功構(gòu)建,我們能夠很好的研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白的作用機(jī)制。
  方法:
  1.構(gòu)建泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)載體
  采用雙酶切方法

3、,將泛素基因和轉(zhuǎn)鐵受體蛋白基因克隆于表達(dá)載體pCI-neo-HA中,測(cè)序正確后提取質(zhì)粒。
  2.泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白載體的表達(dá)及鑒定
  測(cè)序正確的Ub-TfR表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液。通過Western blot、免疫熒光等檢測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)。
  3.PR-619在A431和hela細(xì)胞系中條件優(yōu)化
  通過Western blot檢測(cè)PR-619在A431和hela細(xì)胞系中的最佳條

4、件
  4.Hrs和TSG101 siRNA的最佳條件優(yōu)化
  通過Western blot檢測(cè)Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件
  結(jié)果:
  1.Ub-TfR載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定
  通過酶切后連接,后送公司測(cè)序。測(cè)序正確后,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后裂解細(xì)胞,離心獲得細(xì)胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為95KDa,表明為目的蛋白。免疫熒光證實(shí)了泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)吞后不再

5、回到到細(xì)胞膜,而是通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞內(nèi)體。
  2.PR-619在hela細(xì)胞和A431細(xì)胞中的最佳刺激濃度是30uM,最佳刺激時(shí)間是3小時(shí); Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件都是是轉(zhuǎn)染后48小時(shí)。
  結(jié)論:
  1.成功構(gòu)建了pCl-neo-Ub-TfR表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后表達(dá)的Ub-TfR蛋白明顯增高。免疫熒光證實(shí)了泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體內(nèi)吞后不再回到到細(xì)胞膜,而是進(jìn)入內(nèi)吞途徑并進(jìn)入胞內(nèi)體。

6、為進(jìn)一步研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。
  2.PR-619在hela細(xì)胞和A431細(xì)胞中的最佳刺激濃度是30uM,最佳刺激時(shí)間是3小時(shí); Hrs和TSG101 siRNA干擾的最佳條件是轉(zhuǎn)染后48小時(shí)。這些條件都為進(jìn)一步研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。
  第二部分 EGFR基因與EML4-ALK融合基因突變的檢測(cè)
  近年來(lái),肺癌由于其明顯上升的發(fā)病率和死亡率,已經(jīng)成為了目前死亡率最高的惡性腫瘤。肺癌的主要類

7、型包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌,而85%的肺癌則被診斷為非小細(xì)胞肺癌,小細(xì)胞肺癌占15%。肺癌最主要的治療手段是綜合治療,這些綜合治療主要包括手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療。據(jù)最新研究表明,靶向藥物治療對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者而言是一個(gè)比較好的選擇。隨著人們對(duì)肺癌分子靶點(diǎn)不斷深入的研究,特異性高且不良反應(yīng)輕的分子靶向藥物逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。靶向藥物治療主要是以EGFR基因和EML4-ALK融合基因等肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變?yōu)榘悬c(diǎn)的,所以肺癌在進(jìn)

8、行靶向藥物治療之前的基因檢測(cè)也是非常必要的。
  EGFR是一種分子質(zhì)量為170kDa的細(xì)胞膜受體,是一種受體型酪氨酸激酶。非小細(xì)胞肺癌的形成和發(fā)展過程中,表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)通路起著至關(guān)重要的作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的活化可被表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)選擇性地抑制,從而其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被有效阻斷,在NSCLC中的療效比較好。所以EGFR突變是靶向藥物TKI治療效果的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)之一

9、。EML4-ALK由棘皮動(dòng)物微管查關(guān)蛋白樣-4(EML4)與漸變性淋巴瘤激酶(ALK)兩者的部分基因融合而成,EML4-ALK融合基因是NSCLC中的分子靶標(biāo)之一。EML4-ALK融合基因突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。
  目的:為了給NSCLC患者的靶向藥物治療提供更為可靠的依據(jù),EGFR基因突變和EML4-ALK基因突變的檢測(cè)是很有必要的。有效的生物標(biāo)志物的篩選不僅僅能夠改善療效,同時(shí)還可以提高患者治療成

10、功率。
  方法:
  1.EGFR基因突變檢測(cè)
  采用PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序方法檢測(cè)252例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因外顯子19和21的突變情況。
  2.EML4-ALK融合基因突變檢測(cè)
  采用Realtime-PCR的方法檢測(cè)EML4-ALK融合基因的突變情況。
  結(jié)果:
  1.EGFR基因突變與臨床特征的相互關(guān)系252例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本EGFR的突變率為38.8%(98例),其中

11、19外顯子突變率為15.8%(40例),21外顯子突變23.0%(58例)。EGFR突變的患者多為女性、無(wú)吸煙史和腺癌(P<0.05),與患者年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。
  2.EML4-ALK融合基因突變與臨床特征的相互關(guān)系
  252例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中,EML4-ALK融合基因突變率4.7%(12例)。EML4-ALK基因突變患者多為女性和年齡較小者(P<0.05),與患者吸煙史和病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。

12、r>  3.EGFR和EML4-ALK的突變共存情況
  沒有檢測(cè)到EGFR和EML4-ALK的突變共存情況。
  結(jié)論:
  1.中國(guó)人中NSCLCs的EGFR突變率較高,在使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療前進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)很有必要。
  2.EML4-ALK基因突變?cè)贜SCLC的發(fā)現(xiàn),使臨床NSCLC患者有了一種新的可供選擇的治療方案。
  3.EML4-ALK融合基因突變與EGFR突變共存是罕

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