氬氦冷凍對(duì)腫瘤抑制性樹突狀細(xì)胞的影響及聯(lián)合anti-CTLA4單抗抑制膠質(zhì)瘤的試驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腫瘤之一，占顱腦腫瘤的40％～50％，由于膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，廣泛深入正常腦組織，且對(duì)放化療均不敏感，手術(shù)創(chuàng)傷及放化療又對(duì)機(jī)體免疫力產(chǎn)生抑制和破壞，致使其復(fù)發(fā)率和死亡率普遍居高不下。
　　CTLA4是表達(dá)在活化T細(xì)胞和Treg細(xì)胞上的抑制性共刺激分子受體，anti CTLA4抗體(ipilimumab)在2011年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于晚期有轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者的治療。
　　第一章 氬氦冷

2、凍腫瘤對(duì)免疫抑制性樹突狀細(xì)胞功能的影響
　　目的:研究氬氦冷凍腫瘤后對(duì)于腫瘤引流淋巴結(jié)中的免疫抑制性樹突狀細(xì)胞功能的影響。
　　方法:通過建立皮下GL261膠質(zhì)瘤小鼠模型，利用氬氦冷凍治療或普通手術(shù)切除治療，將小鼠分為空白對(duì)照組、腫瘤對(duì)照組、氬氦冷凍腫瘤組及手術(shù)切除腫瘤組。在給予處理2周后，分離腫瘤引流淋巴結(jié)，流式檢測(cè)腫瘤引流淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞的數(shù)量、表型及白介素10(IL-10)的表達(dá)。利用CFSE流式檢測(cè)腫瘤引流淋巴結(jié)

3、中的樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖能力。利用T細(xì)胞細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力。對(duì)處理小鼠再次接種GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞，檢測(cè)其二次抗腫瘤免疫能力，測(cè)量二次接種腫瘤體積，繪制二次腫瘤生長(zhǎng)曲線。記錄二次腫瘤小鼠生存期，繪制生存期曲線。免疫熒光檢測(cè)二次腫瘤中侵潤(rùn)樹突狀細(xì)胞的表達(dá)。再各組小鼠處理后，清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，記錄各組小鼠生存期，繪制生存期曲線。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建皮下GL261膠質(zhì)瘤小鼠模型并實(shí)施治療分組。二次腫瘤

4、免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除腫瘤組的二次腫瘤組織中侵潤(rùn)的樹突狀細(xì)胞較多的表達(dá)IL-10，而氬氦冷凍腫瘤組的二次腫瘤組織中侵潤(rùn)的樹突狀細(xì)胞則較少的表達(dá)IL-10。在清除Treg細(xì)胞后，空白對(duì)照組小鼠平均生存期為36.6±3.37天，腫瘤對(duì)照+清除Treg組小鼠平均生存期為35.2±4.8天，氬氦冷凍腫瘤十清除Treg組小鼠平均生存期為66.6±7.5天，手術(shù)切除腫瘤+清除Treg組小鼠平均生存期為44.6±5.4天。氬氦冷凍腫瘤+清除Tr

5、eg組小鼠生存期顯著優(yōu)于空白對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.011)。
　　結(jié)論:氬氦冷凍小鼠GL261膠質(zhì)瘤可以改變腫瘤引流淋巴結(jié)中的樹突狀細(xì)胞的數(shù)量及表型，降低免疫抑制因子IL-10的表達(dá)，增強(qiáng)刺激T淋巴細(xì)胞的能力，提高效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)小鼠GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷能力?？裳泳彾谓臃N腫瘤的生長(zhǎng)速度，減少二次腫瘤中侵潤(rùn)表達(dá)IL-10的樹突狀細(xì)胞，同時(shí)予以清除免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg，可增強(qiáng)抵抗二次腫瘤的能力，延長(zhǎng)二次腫瘤生存期。

6、　　第二章氬氦冷凍裂解物聯(lián)合anti-CTLA4抗體原位治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠的療效分析
　　目的:通過探索氬氦冷凍裂解物聯(lián)合anti-CTLA4抗體原位治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠，分析其抗腫瘤療效，研究其抗腫瘤機(jī)制。
　　方法:建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠模型，采用顱內(nèi)原位注射氬氦冷凍裂解物及/或anti-CTLA4抗體，分為腫瘤對(duì)照組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μl GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，不予任何治療。）、anti-CTLA4治療組

7、（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μlGL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗體各一次，每次10μg。）、氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5l GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后第3、6天原位注射氬氦冷凍膠質(zhì)瘤裂解物各一次，每次10μg。)、聯(lián)合治療組（小鼠右腦尾狀核接種1×105/5μl GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后第3、6、9、12天原位注射anti-CTLA4抗體各一次，每次10μ

8、g;第3、6天原位注射氬氦冷凍膠質(zhì)瘤裂解物各一次，每次10μg。），計(jì)算各組生存期，評(píng)估各組神經(jīng)毒性反應(yīng)，分離腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞，流式檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞變化，計(jì)算CD4+、CD8+T細(xì)胞與Foxp3+Treg細(xì)胞比例，檢測(cè)腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞殺傷能力，免疫熒光證實(shí)腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞，提取腦腫瘤組織，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中IL-10、IL-12、IL-4及IFN-gama表達(dá)情況，給予清除CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞后，分析各組小鼠生存

9、期，評(píng)價(jià)其療效機(jī)制。
　　結(jié)果:成功建立腦膠質(zhì)瘤小鼠模型并按照各組實(shí)施治療。治療操作可靠，未見因治療手術(shù)操作死亡小鼠。腫瘤對(duì)照組、anti-CTLA4治療組、氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組、聯(lián)合治療組小鼠平均生存期為28.8±1.31天、39.9±3.8天、32.7±1.7天、51.9±3.4天，治療組生存期均優(yōu)于腫瘤對(duì)照組，(P=0.010，P=0.028，P＜0.001)，anti-CTLA4治療組和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組生存期無

10、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.123)，聯(lián)合治療組生存期優(yōu)于anti-CTLA4治療組及氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組(P-0.046，P=0.001)。神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分中，在腫瘤接種第7天，腫瘤對(duì)照組評(píng)分平均秩次為12.05，聯(lián)合治療組評(píng)分平均秩次為8.95，Z=-1.33，P=0.181，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腫瘤接種第13天，腫瘤對(duì)照組評(píng)分平均秩次為14.2，聯(lián)合治療組評(píng)分平均秩次為6.8，Z--2.87，P=0.004，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

11、腫瘤對(duì)照組評(píng)分高于聯(lián)合治療組評(píng)分。腫瘤對(duì)照組腦組織HE染色，可見腦內(nèi)膠質(zhì)瘤巨大，侵潤(rùn)正常腦組織，而聯(lián)合治療組腦組織HE染色，可見正常腦組織，未見腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)，可見淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)。經(jīng)免疫熒光染色后，腫瘤對(duì)照組中有較少腦CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)。聯(lián)合治療組可見較多的腦侵潤(rùn)C(jī)D4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞，對(duì)于腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對(duì)照組(P＜0.0

12、01)、anti-CTLA4治療組(P-0.002)和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組(P＜0.001);對(duì)于腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD8+T淋巴細(xì)胞的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對(duì)照組(P＜0.001)、anti-CTLA4治療組(P＜0.001)和氬氦冷凍腫瘤裂解物治療組;聯(lián)合治療組中的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量計(jì)數(shù)分別為0.46±0.048/Million、0.71±0.019/Million，顯著高于其他三組（所有P＜0.001）。

13、同樣，腫瘤對(duì)照組與聯(lián)合治療組的脾臟淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.713)，但腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD4+Foxp3-/Foxp3+的比例，聯(lián)合治療組顯著高于腫瘤對(duì)照組(P=0.005);腫瘤對(duì)照組與聯(lián)合治療組的脾臟淋巴細(xì)胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.102)，但腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD8+Foxp3-/Foxp3+的比例，聯(lián)合治療組高于腫瘤對(duì)照組7倍(P=0.

14、003)。在腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞為10、20、40時(shí)，聯(lián)合治療組腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞殺傷效率均高于脾臟淋巴細(xì)胞組(P=0.005、P＜0.001、P＜0.001)和腫瘤對(duì)照組(P=0.007、P＜0.001、P＜0.001)，在聯(lián)合治療組中，腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞對(duì)于GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效率均高于B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞（效靶比-10，P-0.002、效靶比=20，P＜0.001、效靶比=40，P＜0.001）和Hepal-6

15、小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞（效靶比=10，P=0.002、效靶比=20，P＜0.001、效靶比=40，P＜0.001）。同時(shí)，聯(lián)合治療組腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞殺傷GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放的IFN-gama劑量顯著大于正常小鼠脾臟淋巴細(xì)胞(P＜0.001)和腫瘤對(duì)組腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞(P＜0.001)的釋放量。在熒光定量PCR檢測(cè)腦腫瘤組織細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-10的表達(dá)僅為腫瘤對(duì)照組的三分之一(P=0.02)，而氬氦冷凍腫瘤裂解物治

16、療組中IL-10的表達(dá)為腫瘤對(duì)照組的1.6倍(P=0.036)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-12的表達(dá)為腫瘤對(duì)照組表達(dá)的7.17±1.51倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IL-4的表達(dá)為腫瘤對(duì)照組表達(dá)的0.53±0.24倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.024)。聯(lián)合治療組腦腫瘤組織中IFN-gama的表達(dá)為腫瘤對(duì)照組表達(dá)的3.76±0.25倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。在清除CD4+或CD8+淋巴細(xì)胞后，聯(lián)合治

17、療小組小鼠與聯(lián)合治療+ CD4 depletion小鼠生存期無顯著差異(P-0.134)，聯(lián)合治療+CD8-depletion小鼠生存期顯著少于聯(lián)合治療組小鼠，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　結(jié)論:腫瘤原位注射anti-CTLA4抗體聯(lián)合腫瘤凍融裂解物可以治療腦膠質(zhì)瘤小鼠，可以延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，改善小鼠生存期，并且具有較小的神經(jīng)系統(tǒng)毒性。聯(lián)合治療可以增加腦侵潤(rùn)淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例及數(shù)量，增加了效應(yīng)T細(xì)胞與