液相色譜-串聯(lián)質譜法則定貝類中軟骨藻酸及其在小鼠體內(nèi)分布和代謝.pdf

1、記憶缺失性貝類毒素(Amnesicshellfishtoxin，簡稱ASP)是由一種海洋硅藻擬菱形藻Pseudo-nitzschiasp.產(chǎn)生的強神經(jīng)性生物毒素，化學名稱為軟骨藻酸(domoicacid)。自1987年加拿大首次發(fā)生集體貝類食品中毒事件后，人們從赤潮藻類硅藻屬(Diatom)的多列尖刺菱形藻中檢測到軟骨藻酸。魚、貝通過濾食毒藻，將軟骨藻酸富積在體內(nèi)。人類因食用被軟骨藻酸污染的魚、貝而中毒。為了防止ASP中毒事件發(fā)生和保障

2、食品安全，加拿大首先制定了軟骨藻酸在貝類產(chǎn)品中最大安全限量為20μg/g貝肉[4]，隨后，美國、歐洲、以及澳大利亞等國家和地區(qū)也紛紛采用這一標準。根據(jù)歐盟委員會指令(2002/226/EC)，當貝肉樣品中軟骨藻酸的含量超過這一限量時就禁止收獲和上市。
　　 液相色譜-質譜/質譜(LC-MS/MS)是繼液相色譜-質譜(LC-MS)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用之后又一新興的分離分析技術。與已成熟的GC-MS相比具有潛在的發(fā)展?jié)?/p>

3、力，GC-MS只能分析易揮發(fā)、不分解且分子量小的有機物，而LC-MS/MS除了可以彌補GC-MS的不足以外，還具備分離能力強、樣品用量少、分析時間短、選擇性高、靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛應用于蛋白質與肽組學研究、藥物代謝機理、動力學研究、生物化學、有機化學、環(huán)境分析、衛(wèi)生免疫以及食品檢驗等領域。
　　 本論文分為兩個部分，第一部分建立了液相色譜-串聯(lián)質譜測定貝類中軟骨藻酸殘留的檢測方法，為準確快速測定貝類中軟骨藻酸殘留提供可靠的分析

4、技術。第二部分是軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)蓄積性的研究，主要是軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)各個組織中的分布及代謝情況的研究。
　　 本論文目的之一是建立液相色譜-串聯(lián)質譜測定貝類中軟骨藻酸殘留的檢測方法。據(jù)大多數(shù)文獻介紹，軟骨藻酸多采用高效液相色譜-紫外法，其檢測限(LOQ)為1μg/g；還有高效液相色譜-飛行時間質譜法的檢測限(LOQ)為0.1μg/g；而本論文利用液相色譜-串聯(lián)質譜建立一種測定貝類中軟骨藻酸殘留的檢測方法，其目的是建立靈敏度更

5、高、準確度更強、同時具有確認功能的一種分析技術，以滿足目前國際上對有毒物質檢測的要求。方法測定過程如下：優(yōu)化樣品前處理方法，樣品經(jīng)50％甲醇提取，LC-SAX柱凈化，3mL0.1mol/L甲酸溶液洗脫；在色譜條件選擇中：進樣量：25μL；柱溫：30℃；流動相：A：甲醇，B：0.02％甲酸+2mmol/L甲酸銨水溶液；流速為0.35mL/min。優(yōu)化質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，在正離子、多反應監(jiān)測方式(MRM)模式下進行定性與定量，

6、定性離子對為m/z311.98/265.91，m/z311.98/247.9，m/z311.98/192.91，以m/z311.98/265.91為定量離子對，外標法定量。實驗結果表明，該方法的檢出限為0.01μg/g，定量限為0.02μg/g。在0.02～10μg/mL，范圍內(nèi)線性相關系數(shù)為0.9999。當軟骨藻酸添加濃度為20～1000ng/g時，蝦夷扇貝樣品中軟骨藻酸的平均回收率為81.3％～105.4％，相對標準偏差(RSD)為

7、3.90％～8.90％(n=6)；巴菲蛤樣品中軟骨藻酸的平均回收率為91.8％～95.2％，相對標準偏差(RSD)為5.70％～9.20％(n=6)；蜢蟶樣品中軟骨藻酸的平均回收率為78.0％～90.8％，相對標準偏差(RSD)為2.00％～4.20％(n=6)；長牡蠣樣品中軟骨藻酸的平均回收率為83.5％～106.6％，相對標準偏差(RSD)為4.60％～6.40％(n=6)。該方法可靠、靈敏度高，可滿足對貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸殘留的測定

8、。
　　 本論文目的之二是研究軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)各個組織中分布和體外代謝的規(guī)律。首先，驗證了液相色譜-串聯(lián)質譜測定貝類中軟骨藻酸殘留的檢測方法是否適用于以小鼠體內(nèi)各個組織為基質的軟骨藻酸殘留的檢測。實驗結果表明，當軟骨藻酸添加濃度為20～500ng/g時，肝臟樣品中軟骨藻酸的平均回收率為83.4％～86.3％，相對標準偏差(RSD)為5.70％～7.20％；胃樣品中軟骨藻酸的平均回收率為79.4％～85.4％，相對標準偏差(RS

9、D)為5.60％～7.40％；肌肉樣品中軟骨藻酸的平均回收率為81.0％～85.9％，相對標準偏差(RSD)為3.90％～7.70％；腎臟樣品中軟骨藻酸的平均回收率為78.3％～79.4％，相對標準偏差(RSD)為4.70％～6.30％；在0.02～10μg/mL范圍軟骨藻酸的峰面積響應值同軟骨藻酸的量呈線性關系，相關系數(shù)為0.9999，方法的定量限為0.02μg/g。故而該方法適用于小鼠體內(nèi)各組織中軟骨藻酸的檢測。
　　 采用

10、腹腔注射法給小鼠注射一定量的軟骨藻酸溶液，研究注射后小鼠的行為特征以及軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)各個組織中的分布特征及代謝規(guī)律，采用液相色譜-串聯(lián)質譜法測定小鼠體內(nèi)各組織中軟骨藻酸的濃度。按照0.45μg/g體重的注射劑量，采用腹腔注射法對昆明系雄性小鼠進行注射，毒素注射后分別于不同的時間(1h，4h，7h，10h，24h，48h，72h，120h)對小鼠的各組織進行取樣，測定軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)的分布情況。實驗結果表明：小鼠注射軟骨藻酸后，在1

11、-120h時間內(nèi)軟骨藻酸在肝，腎，胃中分布量較大，軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)各個組織中的分布量分別為：肝>胃>腎。而在其他五個組織心，脾，肺，血液和肌肉中只是在短時間內(nèi)有微量軟骨藻酸含量，在毒素注射10小時后這五個組織中軟骨藻酸含量低于方法檢出限。
　　 同時，本文也研究了軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)蓄積率和體外代謝率。通過分析小鼠糞便和尿液，從毒素注射后1-120h，軟骨藻酸在小鼠體外代謝率基本上隨著時間延長而逐漸增加，在毒素注射72h后，軟骨

12、藻酸在小鼠體外代謝率最大并達到81.8％；而軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)蓄積率隨著時間延長而逐漸降低，在毒素注射120h后，軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)蓄積率降至5.6％。由此可得，軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)蓄積率較小，代謝率較大。實驗證明了軟骨藻酸在小鼠體內(nèi)短時間內(nèi)有一定蓄積量，但是毒素注射一周后，80％的軟骨藻酸毒素都排出了體外。同時也說明軟骨藻酸毒素代謝速度比較快，因而可以推測出人們?nèi)舨簧魇秤昧塑浌窃逅嵛廴镜暮．a(chǎn)品(軟骨藻酸含量低于食品安全標準)，不會在體內(nèi)