室溫穩(wěn)定PCR試劑及其在鼠疫菌檢測中的應(yīng)用的研究.pdf

1、鼠疫是人類歷史上最古老、最嚴重的烈性傳染病之一，由于鼠疫的爆發(fā)流行往往給人類造成重大傷亡，所以對鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）的檢測和防治一直被鼠疫學(xué)界和醫(yī)學(xué)界所重視。對于鼠疫菌的檢測方法主要有，傳統(tǒng)的“四步檢驗法”、基于血清學(xué)和核酸的各種方法；以Taqman探針為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法屬于基于核酸的檢測方法之一.
　　 目的：盡管基于Taqman探針的熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被用于檢測和鑒定鼠疫菌多年，關(guān)于定量PCR試劑在室

2、溫條件下的穩(wěn)定性研究卻少見于報道，而在實際應(yīng)用中無論是鼠疫流病調(diào)查、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急和反生物恐怖等，室溫條件下穩(wěn)定的PCR檢測試劑都是必不可少的。本研究中根據(jù)上述現(xiàn)實需求，先建立用于鼠疫菌檢測的熒光定量PCR體系，并在此基礎(chǔ)之上摸索出使試劑在室溫保持穩(wěn)定的方法，為實際應(yīng)用中的需求和將來熒光定量PCR試劑的產(chǎn)品化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：分別根據(jù)鼠疫菌染色體上的3a片段和質(zhì)粒pMTI上編碼F1蛋白的基因cafl設(shè)計引物和探針

3、序列，建立熒光定量PCR的反應(yīng)體系，優(yōu)化了引物和探針的濃度、反應(yīng)體系中鎂離子的濃度以及反應(yīng)的程序的各參數(shù)。
　　 在驗證反應(yīng)體系的特異性實驗里，我們選取的基因組核酸包括：耶爾森氏菌屬的9個種、鼠疫菌的4中生物型（古典型、中世紀型、東方型和田鼠型）、與鼠疫菌非常近緣的假結(jié)核耶爾森氏菌16種血清型，以及常見的土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌、布魯氏菌和大腸桿菌DH5α，另外還包括人血液核酸和小鼠基因組。靈敏度實驗中，以鼠疫菌的疫苗株E

4、V76的系列稀釋菌液作為檢測的樣本，以涂板計數(shù)法確定菌液濃度。
　　 試劑的穩(wěn)定性實驗研究，參考國內(nèi)外的相關(guān)研究和我實驗室的技術(shù)積累，我們將反應(yīng)體系混合后加入糖類物質(zhì)作為穩(wěn)定劑；又因為酶和引物在干燥的條件下保持更久的性質(zhì)，我們將混合好試劑按一個反應(yīng)體系的劑量分裝到各個小管中，然后對試劑真空抽干；在評估經(jīng)過上述處理的試劑的穩(wěn)定性實驗中，我們將抽干試劑避光分別保存于-20℃和37℃，通過高溫加速對試劑的破壞作用，取合適時間點對兩種條

5、件下保存的試劑使用同一濃度的模板反應(yīng)，檢驗試劑在高溫的條件下保持穩(wěn)定的情況。
　　 模擬污染土壤樣本實驗，我們用EV76菌液污染土壤制備模擬的土壤樣本，摸索了一套從土壤樣本中提取核酸、并可成功進行熒光定量PCR的處理流程；還進行了特異性實驗、靈敏度實驗和盲測實驗。
　　 最后我們將自制的產(chǎn)品化試劑與國外同類的鼠疫菌檢測試劑進行了對比實驗，驗證在現(xiàn)場的條件下對于水體樣本和純菌液樣本的檢測效果，為將來使用自制試劑替代進口試劑

6、提供了參考。
　　 結(jié)果：優(yōu)化了熒光定量PCR檢測體系內(nèi)相關(guān)試劑的濃度和反應(yīng)的程序參數(shù)，在驗證反應(yīng)體系的特異性實驗里，我們設(shè)計的引物和探針只對鼠疫菌的四種生物型有陽性結(jié)果，而相關(guān)的近緣菌株和非近緣但是常見的菌株都無陽性反應(yīng)，顯示了引物和探針較好的特異性。體系的靈敏度實驗中，3a的引物和探針對活菌稀釋液的檢測靈敏度為1.5 CFU每反應(yīng)體系，而caf1的引物和探針的靈敏度為15CFU每反應(yīng)體系。
　　 試劑的穩(wěn)定性實驗結(jié)果

7、：試劑加入穩(wěn)定劑并抽干后，在37℃、避光保存的條件下，在至少49天的時間內(nèi)對低濃度的模板（101拷貝/μl）依然可保證檢測靈敏度，而對高濃度的模板（大于102拷貝μl）在79天里依然保證靈敏度。進一步的工作中，我們應(yīng)用上述試劑對使用鼠疫菌疫苗株EV76污染的模擬土壤樣本進行了實驗，3a和caf1引物和探針仍然保持了很好的特異性，可檢測的靈敏度均為5×104 CFU/克土壤；同時我們也摸索了一套簡捷、有效的樣本處理方法。
　　 結(jié)

8、論：PCR反應(yīng)體系在室溫條件下的穩(wěn)定性研究在1995年出現(xiàn)，可是隨后相關(guān)方面的研究工作卻很少，而對于熒光定量PCR檢測體系而言，尚未見到國內(nèi)外相關(guān)的文獻報道，開展這方面的研究無論是對于普通PCR和熒光定量PCR在現(xiàn)場條件下的應(yīng)用和日常的試劑運輸?shù)确矫妫€是為將來我們的試劑可以本土化以取代昂貴的進口試劑方面都具有現(xiàn)實意義。實驗中，真空抽干后的熒光定量PCR檢測試劑在37℃至少可保存49天而保持其檢測準(zhǔn)確性和重復(fù)性，提示在實際應(yīng)用中試劑可以