基于調(diào)控TGF-β-smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)龜鹿二仙膠促進(jìn)成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白改善骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前國內(nèi)外針對骨質(zhì)疏松癥開展了大規(guī)模、多方向的研究，其中中醫(yī)藥治療取得了很大進(jìn)展，但其作用機(jī)制研究多側(cè)重骨礦鹽方面，對膠原蛋白合成的作用機(jī)制研究較少，尤其關(guān)于其作用分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)探索的研究更為少見?；谠摫尘埃覀冞x擇經(jīng)典中藥方劑龜鹿二仙膠，既往研究證實(shí)其具有益精填髓、補(bǔ)腎益氣，對骨質(zhì)疏松模型膠原蛋白形成確有促進(jìn)作用。其作用途徑研究尚未深入，通過何種途徑、何種通路及作用靶點(diǎn)如何？根據(jù)文獻(xiàn)研究，我們推測龜鹿二仙膠是通過調(diào)控TGF-β/

2、Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，刺激成骨細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用，促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白合成，從而起到治療骨質(zhì)疏松的作用。
　　目的:
　　探討龜鹿二仙膠對成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原蛋白及對GIOP斑馬魚模型魚鱗形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)的影響，探討龜鹿二仙膠對成骨細(xì)胞TGF-β/Smad信號通路的影響，分析龜鹿二仙膠對Ⅰ型膠原合成的促進(jìn)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　一、體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞，應(yīng)用中藥龜鹿二仙膠含藥血清培養(yǎng)成骨細(xì)胞，通過Western b

3、lot法檢測成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7等蛋白的合成;RT-PCR檢測成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA的表達(dá)。探索龜鹿二仙膠對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞通過TGF-β/Smads信號通路合成Ⅰ型膠原蛋白的影響。
　　二、采用成年斑馬魚為模型動物，以糖皮質(zhì)激素地塞米松為模型藥，以建立快速、高效的骨質(zhì)疏松

4、新模型。龜鹿二仙膠對該模型進(jìn)行干預(yù)，檢測斑馬魚魚鱗Ca（鈣）、P（磷）、ALP（堿性磷酸酶）、和Hyp（羥脯氨酸）含量，觀察斑馬魚膠原蛋白結(jié)構(gòu)。RT-PCR檢測斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7基因表達(dá)，Western blot法檢測斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表達(dá)，分析龜鹿二仙膠通過TGF-β/Smad信號通路對骨質(zhì)疏松斑馬魚模型Ⅰ型膠原合成的機(jī)制。

5、>　　結(jié)果:
　　1、成骨細(xì)胞Western blot法檢測結(jié)果顯示:給藥24小時，龜鹿二仙膠組高劑量組能使成骨細(xì)胞合成COL1A1、COL1A2增加，其余各組與正常組比較無顯著差異。第48小時，骨化三醇組、低、中、高濃度的龜鹿二仙膠組均能使成骨細(xì)COL1A1及COL1A2蛋白表達(dá)增加，其中，中、高劑量組COL1A1及COL1A2蛋白表達(dá)接近，均優(yōu)于骨化三醇組。給藥24小時和48小時，骨化三醇組TGF-β1、TGF-β2蛋白表達(dá)無

6、明顯增加;龜鹿二仙膠高劑量組對成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2蛋白表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用;給藥48小時，低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2蛋白表達(dá)增加，中、高劑量的龜鹿二仙膠組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥24小時，龜鹿二仙膠高劑量組可以顯著提高Smad3蛋白表達(dá)的量;給藥48小時，低、中、高劑量龜鹿二仙膠組均能使成骨細(xì)胞Srnad3蛋白表達(dá)增加。給藥24小時及給藥48小時，各給藥組的Smad2、Smad4、S

7、mad7蛋白表達(dá)的量與正常組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、成骨細(xì)胞RT-PCR法檢測結(jié)果顯示:骨化三醇組、低、中、高濃度的龜鹿二仙膠組均能使成骨細(xì)胞COL1A1及COL1A2 mRNA水平增加;中、高劑量龜鹿二仙膠組COL1A1、COL1A2mRNA水平增加較明顯;骨化三醇組對TGF-β1及TGF-β2 mRNA表達(dá)均無明顯影響;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2 mRNA水平增加;骨化三醇組

8、、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均對成骨細(xì)胞Smad2、Smad4及Smad7的mRNA水平無明顯影響。骨化三醇組對Smad3的mRNA表達(dá)水平無明顯影響;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能升高成骨細(xì)胞的Smad3的mRNA水平。中、高劑量龜鹿二仙膠組Smad3mRNA水平增加程度接近。
　　3、成功建立激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(GIOP)斑馬魚模型，地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚鱗片的變化，經(jīng)Masson染色觀察，空白組斑馬魚Ⅰ型膠原組織結(jié)構(gòu)

9、致密，交界清晰。地塞米松組自低劑量開始出現(xiàn)膠原結(jié)構(gòu)松散，間隙擴(kuò)大，界限模糊或推移改變，以高劑量組改變最為明顯。造模各組魚鱗Ca含量出現(xiàn)下降，其中中劑量地塞米松組魚鱗Ca含量出現(xiàn)明顯下降;高劑量地塞米松組魚鱗Ca含量下降。中、高劑量地塞米松組魚鱗P含量出現(xiàn)明顯下降;中、高劑量地塞米松組魚鱗ALP含量出現(xiàn)上升。
　　4、龜鹿二仙膠給藥后，龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組Ca含量明顯高于模型組。龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組P含量明顯高于

10、模型組;龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組ALP含量低于模型組，龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組能Hyp含量高于模型組。
　　5、Western-blot法檢測GIOP斑馬魚模型相關(guān)蛋白表達(dá):骨化三醇組、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達(dá)水平升高;其中中、高劑量龜鹿二仙膠組使斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達(dá)水平顯著升高;骨化三醇組TGF-β1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;低、中、高劑量龜鹿二仙膠組均能使GIO

11、P斑馬魚TGF-β1蛋白表達(dá)水平上升。骨化三醇組Smad3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Smad3蛋白表達(dá)水平上升。各組之間斑馬魚Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平相互比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6、RT-PCR法檢測GIOP斑馬魚相關(guān)蛋白mRNA表達(dá):骨化三醇組、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白mRNA水平升高;中、高劑量龜鹿二仙膠組中GIOP斑馬魚Ⅰ