楊樹WRKY54基因的克隆與轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、楊樹生長迅速，豐產(chǎn)，木材用途廣，是短期輪伐造林時普遍選用的樹種。此外，楊樹人工林在生態(tài)環(huán)境治理中占有重要的地位。然而，楊樹是一種多年生樹種，整個生長周期都會受到病害的威脅，各種病害嚴重影響楊樹的生長發(fā)育，造成較大的經(jīng)濟損失。WRKY基因普遍地介入到植物對環(huán)境脅迫的應(yīng)答、植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)控、植物對多種病原體的防御響應(yīng)等一系列生理活動。
　　本研究利用生物信息學(xué)軟件及在線楊樹等植物的全基因組數(shù)據(jù)庫，對楊樹PtrWRKY54基因進

2、行系統(tǒng)發(fā)育分析、序列分析、表達模式分析、亞細胞定位分析、轉(zhuǎn)錄活性分析。此外，我們克隆得到了PtrWRKY54基因并構(gòu)建過表達載體，利用葉盤法對南林95楊樹進行遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗生素篩選、PCR鑒定和GUS染色鑒定。獲得以下主要結(jié)果：
　　1.從南林95楊中克隆得到楊樹PtrWRKY54。該基因CDS全長為969bp，推定蛋白長度為322aa。預(yù)測的編碼蛋白擁有1個WRKY domain和1個C2HC型的鋅指結(jié)構(gòu)。

3、r>　　2.系統(tǒng)發(fā)育分析表明：16個同源WRKY基因分別聚成單子葉和雙子葉2個大枝上；PtrWRKY54與抗病相關(guān)的兩個WRKY基因PtrWRKY89和AtWRKY70的進化關(guān)系較近。序列分析表明：PtrWRKY54與擬南芥AtWRKY70的motif和基因結(jié)構(gòu)高度相似；啟動子區(qū)域作用元件分析表明PtrWRKY54啟動子區(qū)域含有抗真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件與防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件。
　　3.組織表達模式分析發(fā)現(xiàn)PtrWRKY54在分化中的木質(zhì)

4、部中表達量最高。誘導(dǎo)表達模式分析表明該基因表達量受SA處理后明顯升高，傷害的誘導(dǎo)次之，MeJA處理最不明顯；兩種活體柵銹菌混合處理比單獨處理時表達量高。
　　4. PtrWRKY54-GFP融合表達載體轉(zhuǎn)化本氏煙葉片進行亞細胞定位實驗，結(jié)果顯示PtrWRKY54定位在細胞核。
　　5.構(gòu)建pGBKT7-PtrWRKY54載體進行酵母轉(zhuǎn)錄活性實驗，結(jié)果表明PtrWRKY54具有自轉(zhuǎn)錄活性。
　　6.構(gòu)建pRI201-AN