四因子誘導(dǎo)iPSCs方法的改良及大鼠腎臟固有細(xì)胞來源的iPSCs的獲得.pdf

1、背景:近年來，慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。對(duì)于終末期腎臟病患者，主要的替代治療方法是透析和腎移植。但是不論哪種方法都不能很好地維持其機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，更不能替代腎臟的分泌功能，而且腎移植供體供不應(yīng)求。組織工程與干細(xì)胞領(lǐng)域的突飛猛進(jìn)為器官再生帶來了希望。有研究表明利用小鼠脫細(xì)胞的腎臟細(xì)胞外基質(zhì)作為骨架，通過腎動(dòng)脈向骨架內(nèi)灌注小鼠胚胎干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞可在骨架內(nèi)定植，并能分化為相應(yīng)的腎臟固有細(xì)胞。此前，課題組

2、已成功獲取大鼠脫細(xì)胞腎臟骨架并對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行了檢測。但是胚胎干細(xì)胞存在倫理問題。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)具有與胚胎干細(xì)胞類似的全能特性。利用iPSCs代替胚胎干細(xì)胞，不僅解決了倫理問題，同樣在保持大量擴(kuò)增能力的同時(shí)還具有胚胎干細(xì)胞的發(fā)育能力。
　　目的:綜合國內(nèi)外加速體細(xì)胞重編程效率的有效方法改良iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率,并提取原代的大鼠腎臟固有細(xì)胞，分別誘導(dǎo)為不同來源的iPS細(xì)胞，最后再灌注到脫細(xì)胞腎骨架中觀察其生存情況。<

3、br>　　方法:
　　(1)利用慢病毒載體結(jié)合抑制細(xì)胞的Mbd3基因，并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入維生素C加血清替代物，同時(shí)適當(dāng)提高接種密度的方法改良iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率;
　　(2)分別提取并培養(yǎng)原代的大鼠腎臟系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等主要的腎臟固有細(xì)胞，分別誘導(dǎo)為不同細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞，并做熒光標(biāo)記;
　　(3)將帶有熒光標(biāo)記的iPS細(xì)胞灌注到脫細(xì)胞腎骨架中觀察其存活情況。
　　

4、結(jié)果:
　　(1)利用改良過的iPS誘導(dǎo)方法成功將誘導(dǎo)周期由7天縮短至5天;
　　(2)利用篩網(wǎng)及貼壁法，成功提取了主要的腎臟固有細(xì)胞，并分別用改良方法誘導(dǎo)成為各種不同細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞，保留了對(duì)不同腎臟固有細(xì)胞的記憶性;
　　(3)將帶有RFP的大鼠iPS細(xì)胞灌入脫細(xì)胞腎骨架中，48小時(shí)后在雙光子顯微鏡下觀察其生長情況，結(jié)果示其生長狀態(tài)良好。
　　結(jié)論:
　　(1)改良過的iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法可縮短iP