大彈涂魚性腺中兩種Hepcidin的研究.pdf

1、大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）分布于我國東南沿海潮間灘涂，生活于洞穴之中，因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國東南沿海的重要的養(yǎng)殖魚類之一。前期的研究發(fā)現(xiàn)，生殖季節(jié)雄性大彈涂魚在洞穴中建造產(chǎn)卵室，性成熟的雌雄魚在產(chǎn)卵室內(nèi)交配產(chǎn)卵，受精卵粘附在產(chǎn)卵室的頂部和四周，仔魚需要5d才能孵出。雖然洞穴內(nèi)底泥和海水含有許多致病菌，但大彈涂魚受精卵在孵化期間卵膜和胚體始終保持清潔透明狀態(tài)，孵化率達(dá)到99.7％。為了了

2、解大彈涂魚在生殖過程中的免疫抗菌機(jī)制，本文采用了分子生物學(xué)等方法克隆了大彈涂魚兩種Hepcidin基因亞型（Hepcidin-1和Hepcidin-2），并研究了其在大彈涂魚不同組織中的表達(dá)、不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)變化、生殖前期和生殖高峰期時(shí)不同的表達(dá)情況以及Hepcidin-2在精巢和貯精囊中的細(xì)胞定位。主要結(jié)果如下:
　　1.Hepcidin-1基因的部分片段長412bp，其中開放閱讀框長267bp，編碼一個(gè)由88個(gè)氨基酸組成的

3、多肽片段。Hepcidin-2基因的部分片段長345bp，其中開放閱讀框長267bp，編碼一個(gè)由88個(gè)氨基酸組成的多肽片段。
　　2.蛋白質(zhì)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚的兩種Hepcidin多肽結(jié)構(gòu)與其他硬骨魚類中的Hepcidin的結(jié)構(gòu)相似，有8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，由這些半胱氨酸殘基在成熟肽中形成的二硫鍵維持著多肽反向平行β-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。大彈涂魚多肽序列的N端有一個(gè)推測(cè)與鐵離子調(diào)控相關(guān)的氨基酸殘基序列:Q-S/I-H-L/I

4、-S/A，Hepcidin-2中沒有此序列。用部分已知的脊椎動(dòng)物Hepcidin蛋白序列建樹分析發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚Hepcidin-1和Hepcidin-2分別屬于HAMP1和HAMP2亞型。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量方法分析結(jié)果顯示，Hepcidin-1主要分布于大彈涂魚的肝臟組織中;而Hepcidin-2分布相對(duì)廣泛，除了在肝臟中表達(dá)量較高之外，在脾和精巢中也有較高的表達(dá)。
　　4.以LPS（lipopolysaccharid，

5、脂多糖）和Dextran-iron注射大彈涂魚，研究兩種Hepcidin基因在雄魚性腺中的表達(dá)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射LPS后6h，精巢和貯精囊組織中Hepcidin-1的表達(dá)量都顯著上調(diào)，而Hepcidin-2在這兩個(gè)組織中則是從3h開始一直到24h都顯著高于對(duì)照組;注射Dextran-iron24h之后只有在肝臟中Hepcidin-1才有顯著的上調(diào)。
　　5.熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，Hepcidin-1在生殖高峰期（5-6月）的表達(dá)量

6、在精巢組織中沒有顯著變化，而在生殖前期（3月）的表達(dá)量在貯精囊中有顯著的上調(diào)。Hepcidin-2無論是在精巢還是在貯精囊中，從1月到6月呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)，在生殖高峰期達(dá)到最高，說明生殖季節(jié)Hepcidin-2基因在大彈涂魚雄魚性腺中可能起到了重要的免疫作用。
　　6.為了了解Hepcidin-2與性腺發(fā)育的關(guān)系，使用催產(chǎn)素LHRH-A3在非生殖期（11月）注射大彈涂魚。結(jié)果表明，注射后24h貯精囊和精巢之中Hepcidin-