微損傷環(huán)境下干細胞移植治療骨不連的動物試驗研究.pdf

1、骨不連是目前骨科臨床面臨的重要難題之一，其治療方案較多，但效果不一，干細胞治療的興起為骨不連的治療從根本上提供了一種潛在的良好治療方案，有著良好的應用前景。骨修復過程中，需要骨折部聚集數量足夠的骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。所以，向骨折骨不連部位引入足夠的MSCs是促進骨修復的前提條件及重要的細胞學基礎。由此干細胞就成為治療骨不連的理想的種子細胞。
　　干細胞

2、移植治療骨不連有著良好的臨床應用前景，同時微損傷環(huán)境為干細胞提供龕環(huán)境，既結合了干細胞的修復功能的特性，又引入了局部微損傷的支持培養(yǎng)誘導分化環(huán)境。
　　目的：本試驗以兔橈骨骨缺損骨不連模型行微損傷環(huán)境下干細胞治療，從示蹤、病理、影像、統(tǒng)計等多個方面全面反應微損傷環(huán)境下干細胞移植治療骨不連的療效。
　　方法：動物體內對照試驗。選取20只新西蘭大白兔，隨機分為兩組：試驗組(干細胞組)和對照組(單植骨組)。抽吸兔的脛骨骨髓血，采用

3、全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法分離培養(yǎng)兔BMSCs。培養(yǎng)達到107數量級后以超順磁氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide，SPIO)培養(yǎng)標記BMSCs備用。應用形成骨缺損法制作骨不連模型。選擇兔前肢橈骨中段，截骨長度為15mm，觀察時間為6周。造模成功后，試驗組在局部微損傷環(huán)境下行取自體髂骨碎骨粒植骨，同時行同種異體干細胞移植術。單植骨組只行自體髂骨碎骨粒植骨。術后第1-12周分別進行相關檢查對比觀察，包括：1.

4、大體形態(tài)學觀察；2.病理學觀察：HE染色和普魯士藍染色，反應成骨及細胞演化情況；3.MRI動態(tài)活體體內干細胞跟蹤，掃描序列為：3D fsSPGRE、T2*GRE、T1 FSE。4.X線影像學的觀察：術后對試驗兔行X線檢查，觀察橈骨骨不連的骨質愈合及骨痂變化情況。5.利用實達PACS影像診斷工作站系統(tǒng)測量x線片各骨痂形成面積，所得2組骨痂面積對比，應用統(tǒng)計學SPSS軟件分析兩組數據，P＜0.05則認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果：20只

5、新西蘭大白兔全部存活，進入結果分析。
　　1.干細胞分離培養(yǎng)擴增MSCs的形態(tài)學觀察：分離后梭形細胞和多角形細胞顯著增多，集落方式生長，數量逐漸增多，呈現長梭形、紡錘形，消化傳代擴增純化至第3代備用，干細胞數達到107數量級。干細胞呈紡錘形和長梭形，且具有干細胞物理性貼壁粘附及集落生長的特性鑒定為兔BMSCs。
　　2.造模6周后，觀察試驗兔全部成活良好?；贾锌谟狭己?，活動良好，觸摸可及橈骨段缺損凹陷。X片示：橈骨中段骨

6、質缺損無骨性連接，斷端硬化，骨髓腔封閉。
　　3.在骨不連植骨術后第1—12周分別進行干細胞組與單純植骨組相關對比觀察。
　　3.1 大體形態(tài)學觀察：術后3周標本觀察兩組外形差異不大。術后6周觀察干細胞組骨痂較大；單純植骨組對照側可見骨痂明顯減少，植骨碎骨粒吸收。術后8周干細胞組見骨痂明顯增大，植入碎骨粒融合，骨不連缺損愈合良好；植骨組可見骨髓腔大部封閉，肉芽組織增生。術后12周觀察干細胞組完全修復，單植骨組植骨吸收，髓腔閉

7、塞，肉芽組織填充。
　　3.2 SPIO標記的干細胞，標記后的BMSCs在T2WI、尤其GRE(T2*WI)序列信號明顯降低，在T1 FSE序列中片狀植骨區(qū)內可以分辨出中等點狀圓形信號，提示為標記的BMSCs的典型表現，能夠較好的分辨干細胞。隨著時間的推移干細胞增殖代謝致使干細胞核磁顯影逐漸降低，大約觀察時間在8周左右，表明8周內標記的干細胞具有活力。單植骨單植骨組無相關改變。
　　3.3 各組治療術后骨缺損不連X片成像結果

8、：術后2周干細胞組與單植骨組橈骨X線檢查無明顯差異。自第3周可以明顯看出單植骨組較干細胞組骨粒密度及面積明顯降低減少。4周后可見單植骨組骨顆粒明顯減少吸收；干細胞組在骨缺損區(qū)可見云霧狀新骨生長的改變。6周單植骨組可見骨顆粒大部分吸收，骨髓腔部分閉塞；干細胞組缺損區(qū)呈云霧狀影，骨痂豐富，骨髓腔部分再通。術后8周單植骨組缺損區(qū)無骨性連接，植骨吸收；干細胞側呈大骨痂，缺損區(qū)呈骨性連接，骨髓腔再通。術后12周單植骨組缺損區(qū)無骨性連接，斷端硬化，

9、骨髓腔封閉；干細胞組缺損區(qū)呈骨性連接，骨髓腔再通，塑性良好。
　　3.4 病理組織學：2周時兩組組織病理形態(tài)對比差異不大。可見纖維結締組織、大量炎性細胞聚集，可見大量死骨碎片。3周干細胞組病理切片可見大面積軟骨細胞增生活躍。單植骨組死骨數量較多，軟骨增生較差。6周時干細胞組骨粒植骨融合，可見新生類骨質，成骨細胞增多，普魯士藍染色可見局部細胞胞內藍染顆粒陽性的干細胞，干細胞已經部分分化為成骨細胞；單植骨組內有纖維結締組織長入，軟骨細

10、胞增生不明顯，成骨細胞較少，骨粒吸收減少，死骨較多，骨組織結構紊亂，做普魯士藍染色未見到藍染顆粒。8周時干細胞組大量編織骨樣組織，可見較多成骨細胞，排列較整齊，骨結構接近正常形態(tài)；單純植骨單植骨組可見大量肉芽組織。12周時干細胞組骨缺損完全修復。單植骨組可見肉芽組織填充，無骨性連接。
　　3.5 采集的X片圖像，采用實達PACS影像診斷工作站測量功能，分析統(tǒng)計骨缺損區(qū)域骨痂的面積變化。用統(tǒng)計學方法使用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行