血液中傷寒沙門菌全菌抗原及invA和fimA基因測(cè)定快速診斷腸熱癥.pdf

1、目的: 建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）和斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)（DIGFA）測(cè)定患者標(biāo)本中沙門菌invA基因和全菌細(xì)胞抗原的方法，應(yīng)用于早期快速診斷腸熱癥。 方法: 1．在一定條件下用膠體金標(biāo)記純化后的抗體，制備金標(biāo)探針。 2．先將硝酸纖維素膜用PBS處理，之后用純化的沙門菌全菌抗體進(jìn)行包被，待包被過(guò)的硝酸纖維素膜經(jīng)封閉液處理后制成沙門菌抗原的檢測(cè)裝置，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。 3．收集急性發(fā)熱患者

2、就診當(dāng)天的血清或血漿（所有標(biāo)本為與血培養(yǎng)標(biāo)本同時(shí)采集的）標(biāo)本，且最后經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)為沙門菌感染；其他細(xì)菌感染、自身免疫疾病患者和肝炎病人以及健康體檢人員血清或血漿作為陰性對(duì)照。同時(shí)用DIGFA和肥達(dá)反應(yīng)檢測(cè)。 4．對(duì)LAMP和DIGFA方法進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，并分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證兩種方法的特異性。 5．用LAMP直接從血培養(yǎng)瓶和糞便標(biāo)本中檢測(cè)沙門菌特異invA基因、PCR直接從血培養(yǎng)瓶和糞便標(biāo)本中檢測(cè)沙門菌特異fim

3、A基因，用培養(yǎng)方法結(jié)果對(duì)基因擴(kuò)增的LAMP方法檢出率進(jìn)行評(píng)價(jià)；查看LAMP法陽(yáng)性結(jié)果與最后的培養(yǎng)結(jié)果和DIGFA結(jié)果是否一致。 6．收集上述經(jīng)初次DIGFA檢測(cè)結(jié)果為陰性患者2～3后的血清或血漿標(biāo)本，繼續(xù)用DIGFA檢測(cè)。 7．收集未做血培養(yǎng)或血培養(yǎng)陰性，臨床癥狀典型，而患者前后兩次肥達(dá)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果由陰性變?yōu)殛?yáng)性或有4倍滴度以上升高臨床診斷疑似沙門菌感染患者的血清或血漿標(biāo)本。 8．將血液標(biāo)本中的抗原檢測(cè)以及糞便標(biāo)

4、本中的特異基因檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)方法結(jié)果相比較，驗(yàn)證快速診斷腸熱癥的合理性。 結(jié)果: 1．經(jīng)過(guò)培養(yǎng)方法確診的14例沙門菌感染患者急性發(fā)熱期血清或血漿標(biāo)本，在DIGFA首次檢測(cè)中共有7例陽(yáng)性，檢出率為50％，檢測(cè)過(guò)程5～10min內(nèi)即可完成；而同期肥達(dá)反應(yīng)有5例陽(yáng)性，檢出率為35．7％，需要24h。而2～3日后7例陰性患者的新標(biāo)本再次檢測(cè)中新增3例肥大反應(yīng)陽(yáng)性，而在這之中有2例DIGFA法陽(yáng)性。 2．其他細(xì)菌感染20例

5、、自身免疫疾病患者和肝炎病人各20例以及健康體檢人員30例血清或血漿標(biāo)本經(jīng)DIGFA檢測(cè)均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，特異性100％。而肥達(dá)反應(yīng)出現(xiàn)了幾例陽(yáng)性標(biāo)本。 3．對(duì)于91份血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警瓶和30份糞便培養(yǎng)標(biāo)本，用常規(guī)培養(yǎng)方法分別檢測(cè)到了18株和3株沙門菌；用LAMP檢測(cè)invA基因和普通PCR方法檢測(cè)fimA基因均分別檢測(cè)到了18例和5例陽(yáng)性標(biāo)本，且傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果相符；以培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，兩種基因擴(kuò)增方法靈敏度和

6、特異度均達(dá)到了100％。LAMP方法最低檢測(cè)限達(dá)到了102 cfu/mL，三種方法檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)為X2=0．146，P=0．929>0．1。 4．對(duì)于5例未做培養(yǎng)或培養(yǎng)陰性，且前后兩次肥達(dá)反應(yīng)由陰性變?yōu)殛?yáng)性或4倍滴度升高的臨床診斷疑似沙門菌感染患者，經(jīng)DIGFA檢測(cè)，共有3例陽(yáng)性。 5．DIGFA和LAMP檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)本，通過(guò)金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法驗(yàn)證，這些標(biāo)本均為沙門菌感染，而且DIGFA為陽(yáng)性的標(biāo)本結(jié)果也同LAMP一致。

7、 結(jié)論: 1．DIGFA快速檢測(cè)出臨床血清或血漿標(biāo)本中的沙門菌抗原組分，對(duì)早期診斷腸熱癥有很高臨床價(jià)值，其檢測(cè)時(shí)間10min內(nèi)即可完成，明顯短于檢測(cè)抗體肥達(dá)反應(yīng)的24h，培養(yǎng)方法的48～72h。而且簡(jiǎn)單、特異，無(wú)需相關(guān)技術(shù)人員和特殊設(shè)備。 2．LAMP和普通PCR有很高的靈敏度和特異度，LAMP檢測(cè)沙門菌時(shí)間在1h內(nèi)，普通水浴即可完成，且最低檢測(cè)限可以達(dá)到102 cfu/mL菌液濃度。所需時(shí)間也大大短于培養(yǎng)方法的