LOX-1體外研究模型的建立及其功能檢測.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是威脅人類健康的常見心腦血管系統(tǒng)的疾病，常累及大中型血管，以血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間大量脂質(zhì)堆積、單核/巨噬細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌增殖等為特征。在AS發(fā)生發(fā)展過程中，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)通過細(xì)胞表面清道夫受體(SR)被細(xì)胞攝取，使其形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞大量沉積在血管壁是AS發(fā)生的標(biāo)志。SR在攝取脂質(zhì)時不受胞內(nèi)脂質(zhì)代謝負(fù)反饋調(diào)節(jié)，可使細(xì)胞無限制的攝取ox-LDL，使其在細(xì)胞內(nèi)不斷堆積，導(dǎo)致細(xì)胞

2、破裂形成血管壁脂質(zhì)斑塊。同時，血管內(nèi)皮細(xì)胞也通過SR攝取ox-LDL，除引起內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)堆積外，還引發(fā)一系列內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，這更加劇了AS的進展。LOX-1是一種新型的清道夫受體，最早發(fā)現(xiàn)于牛血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，隨后研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞上也有表達(dá)。LOX-1在結(jié)構(gòu)上與已知的SR家族其他成員不同，在功能上有所較大差異。巨噬細(xì)胞上的LOX-1能增加細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取，參與泡沫細(xì)胞的形成；而表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞表面的LOX-1與ox-LDL結(jié)

3、合后可活化ox-LDL/LOX-1系統(tǒng)，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞的一系列功能改變，引起血管平滑肌細(xì)胞增殖，逐步向內(nèi)膜遷移，加劇管腔狹窄，促進AS的進展。目前研究已證實LOX-1作為SR家族的一員，在脂質(zhì)結(jié)合與代謝中有重要作用，但是，對于LOX-1在眾多致AS因素中的關(guān)鍵作用尚不十分清楚，尤其阻斷LOX-1功能后細(xì)胞功能變化的報道亦不多見。本實驗室曾對SR家族眾多成員在泡沫細(xì)胞形成過程中的功能進行過系統(tǒng)研究，本課題在前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步探討了

4、LOX-1與ox-LDL特異性結(jié)合能力以及阻斷LOX-1后相應(yīng)細(xì)胞功能的變化，明確了LOX-1在脂質(zhì)代謝中的重要作用，為進一步探討LOX-1與脂質(zhì)結(jié)合的關(guān)鍵位點提供了有效的研究手段。
　　 本課題利用佛波醇酯(PMA)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞株THP-1形成巨噬細(xì)胞，并從該細(xì)胞中獲得cDNA文庫，采用分子克隆方法得到LOX-1基因片段，利用EGFP-C1質(zhì)粒作為克隆載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使低表達(dá)SR的293T細(xì)胞過表達(dá)LOX-1，并能與o

5、x-LDL特異性結(jié)合。再采用RNAi技術(shù)對該受體沉默后觀察細(xì)胞與ox-LDL結(jié)合變化，設(shè)計了針對LOX-1的3個SiRNA干擾片段，并利用pSilence1.0質(zhì)粒作為載體，構(gòu)建了3個干擾質(zhì)粒。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將它們轉(zhuǎn)染到過表達(dá)LOX-1的293T細(xì)胞中。通過聚合酶鏈反應(yīng)方法(RT-PCR)，Westernblotting以及流式細(xì)胞技術(shù)(FACS)成功篩選出了針對LOX-1的高效干擾片段SiRNA1。
　　 本研究成功的建立

6、起了過表達(dá)LOX-1的293T細(xì)胞模型，研究結(jié)果顯示：在原本低表達(dá)SR的293T細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染LOX-1后，細(xì)胞與脂質(zhì)結(jié)合能力明顯增強（增加了6.3倍）。同時，構(gòu)建并篩選出了以CTG AAT GAG AAA TCC AAAGA為靶序列的短發(fā)夾RNA重組質(zhì)粒，該質(zhì)?？商禺愋缘某聊琇OX-1基因的表達(dá)，mRNA水平沉默效率80％，蛋白水平沉默效率達(dá)86%，LOX-1基因沉默以后與過表達(dá)LOX-1的293T細(xì)胞相比，結(jié)合ox-LDL的能力下降