從DC-TH軸探討miR-150-5P在慢性鼻-鼻竇炎中的作用.pdf

1、慢性鼻鼻竇炎(chronic rhinosinusitis, CRS)是一類以鼻腔和鼻竇粘膜的慢性炎癥為特征的耳鼻咽喉頭頸外科常見多發(fā)病，目前學術(shù)界普遍將CRS分為慢性鼻鼻竇炎伴息肉(CRSwNP)和慢性鼻鼻竇炎不伴息肉(CRSsNP)兩個疾病亞型。CRS的治療目的也僅僅是控制臨床癥狀和減少并發(fā)癥的發(fā)生，目前還不能達到根治的目的，原因在于CRS的發(fā)病機制復雜，尚不完全清楚。最近的研究表明，可能與遺傳基因、環(huán)境、變態(tài)反應(yīng)、CRS的重塑、解

2、剖結(jié)構(gòu)、先天性免疫、細菌生物膜等有關(guān)，然而究竟是哪種因素是引起CRS的關(guān)鍵因素，有必要進行深入的研究。但目前研究顯示，樹突狀細胞(dendritic cell, DC)、Th17/Treg失衡和microRNAs（miRNAs）是CRS發(fā)病的重要基礎(chǔ)，然而其的發(fā)生機制尚未闡明，本研究將從DC-Th軸探討miRNA在CRS中的作用。
　　DC是機體內(nèi)一種專職抗原提呈細胞,因其表面有樹突狀突起而得名。DC在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要的作用

3、，不同的DC可以相互作用和調(diào)節(jié)。DC是如何影響免疫系統(tǒng)中其它細胞的功能呢？一方面，DC對外來微生物進行識別、攝取、加工處理和提呈，在天然免疫中發(fā)揮抗微生物感染的作用；另一方面，DC捕獲抗原后能與初始T(na?ve T)細胞相互作用，激活na?ve T細胞，并通過分泌IL-17、IL-12、IL-10等細胞因子調(diào)控輔助性T(Th)細胞的誘導、分化，從而對啟動和維系Th細胞反應(yīng)起到?jīng)Q定性作用，調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答。DC作為抗原遞呈細胞，功能強

4、大，能夠阻止微環(huán)境中病原體的侵入，成熟的DC可以遷移到淋巴結(jié)而發(fā)生抗原遞呈的作用，還可刺激T細胞增殖。在T細胞介導的機體細胞免疫中，CD4+Th細胞具有重要意義，na?ve T細胞在抗原提呈細胞的誘導下可分化為Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和T調(diào)節(jié)性細胞（Tregulatory cells，Treg）發(fā)揮不同作用。MiRNAs是一類單鏈的非編碼RNA分子，長約19-22核苷酸，能夠干預(yù)靶基因沉默的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和抑制目標mRNA翻譯蛋

5、白質(zhì)。因此，miRNAs是一類有望調(diào)節(jié)上氣道炎癥的微小分子，也就是在CRS中同樣發(fā)揮作用。借助以上關(guān)于miRNAs在各慢性炎癥性疾病中作用以及miRNA在DC中作用的研究結(jié)果，我們推測在CRS發(fā)病機制中DC-Th軸的異常必然有相當數(shù)量的miRNA參與其中。然而，參與DC-Th軸異常的miRNA表達譜具體如何？不同亞類的CRS是否存在共有和特異的差異表達miRNA? miRNA對DC-Th軸調(diào)控的機制如何？是否可以通過干預(yù)差異表達miRN

6、A調(diào)控DC-Th軸的平衡，最終達到疾病預(yù)防和治療的目的？
　　為了更有效的治療CRS，有必要探索以上科學問題。本研究以CRS患者為研究對象，以DC-Th軸為主線，以miRNA對DC的調(diào)控為切入點，明確CRS患者DC相關(guān)的miRNA表達譜，探討miRNA對DC-Th軸的調(diào)控作用，以期從DC層面闡明CRS中Th細胞失衡的上游分子事件及調(diào)控機制，為CRS發(fā)病機制的研究及臨床防治策略的建立提供新的靶點和新的思路。
　　第一部分不同類

7、型CRS患者外周血中DC表型分布的研究
　　目的：采用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測 DC在CRS外周血中的表型、數(shù)量、分布特征，比較它們之間的差異，觀察DC在CRS發(fā)病機制中的作用。
　　方法：收集2014年7月-2015年8月67例CRS患者，參照EPOS2012的診斷標準分為4個組：①正常對照組：選擇單純鼻中隔偏曲患者(13例)；② CRSsNP：為不伴鼻息肉的CRS患者(18例)；③ atop

8、ic CRSwNP：伴變應(yīng)性體質(zhì)的慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者(18例)；④non-atopic CRSwNP：不伴變應(yīng)性體質(zhì)的慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者(18例)。采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），再用免疫磁珠法分離得到CD+14單核細胞，在白細胞介素-4（interleukin-4, IL-4）和粒細胞集落刺激生物因子(granulo

9、cyte-macrophage colony stimulating Factor,GM-CSF)誘導培養(yǎng)后得到DCs，通過流式細胞術(shù)，檢測CRS外周CD80、CD83、CD1a和CD86(DC成熟和活化標志)的表達。評價不同類型CRS外周血DC的表型、數(shù)量及分布特征。
　　結(jié)果：CRS患者外周血中DC的分布情況：從FCM散點圖可以看出成熟DCs的陽性比例：control38.98％；CRSsNP57.77%；atopic CRS

10、wNP84.87%；non-atopic CRSwNP82.94%。同對照組相比，CRS中成熟DCs均高于對照組，而息肉組中成熟DCs高于非息肉組，伴有變應(yīng)性體質(zhì)的明顯高于不伴有變應(yīng)性體質(zhì)。P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：DCs在CRS外周血中增多，DC在 CRS患者的發(fā)病機制中可能扮演著重要的角色；而 atopic組表現(xiàn)為更多的DC分布，提示變應(yīng)性因素可能促使DC增多。因此，對于伴有變應(yīng)性體質(zhì)的CRS患者，除了手術(shù)治

11、療外，還應(yīng)積極抗過敏治療。
　　第二部分確定CRS患者外周血DC的miRNA表達譜
　　目的：通過對CRS患者樣本外周血中DC提取RNA后進行基因芯片檢測，再用實時熒光定量PCR技術(shù)進一步驗證芯片結(jié)果，確定出CRS患者外周血中DC的miRNA表達譜，并進行定量分析，篩選差異表達miRNA。評價CRS患者不同亞型CRS共有和特有的差異表達miRNA。旨在探討篩選出具有代表性的差異表達miRNA在CRS發(fā)生發(fā)展中的作用。

12、　　方法：分別收集3個組的CRS患者及對照組樣本的外周血，先分離PBMC，予以免疫磁珠法分離CD14+的單核細胞，予以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導為成熟的DCs；再利用Trizol裂解蛋白之后，酚-氯仿反復抽提，提取DC中總RNA，采用miRNA基因芯片分析技術(shù)進行檢測，再用實時熒光定量PCR技術(shù)進一步驗證芯片結(jié)果，確定出CRS患者外周血中DC的miRNA表達譜，并進行定量分析，篩選差異表達miRNA。

13、r>　　結(jié)果：MiRNA基因芯片結(jié)果顯示：同對照組相比，不同類型的CRS患者外周血中DCs有不同的差異表達的miRNA,在這3種類型的CRS中共有31種差異表達的miRNAs，其中有5種miRNAs表達是上調(diào)，有25種miRNAs表達是下調(diào)，而miRNA-1290表達在CRSsNP中是下調(diào)，在atopic CRSwNP和non-atopic CRSwNP中是上調(diào)。
　　結(jié)論：通過對3種類型的CRSmiRNA基因表達的比較，我們推測

14、差異表達的miRNA有可能通過調(diào)節(jié)DCs來干預(yù)CRS的發(fā)病機制，這些miRNAs有可能是治療CRS的一個新靶點。
　　第三部分從DC-Th軸探討miR-150-5P在CRS中的作用
　　目的：通過DC與原始T細胞（na?ve T細胞）共培養(yǎng)后，利用FCM檢測T細胞的增殖情況和培養(yǎng)后上清液的IL-17的濃度情況，從DC-Th軸探討miR-150-5P在CRS中的表達，評價在CRS中miR-150-5P引起Th17/Treg失衡

15、的上游事件和它的免疫調(diào)節(jié)因素。
　　方法：從不同類型CRS外周血中分離的DCs，誘導成熟后，轉(zhuǎn)染miR-150-5P模擬劑/抑制劑（mimic/inhibitor）后,與CFSE標記的同源異體的na?ve T細胞共培養(yǎng)5天(1:20)，收集T細胞，予anti-CD3和anti-CD28刺激，通過FCM檢測CFSE標記的T細胞比率，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA

16、）檢測IL-17的濃度。
　　結(jié)果：同未轉(zhuǎn)染相比，轉(zhuǎn)染miR-150-5P mimic組的T細胞增殖和Il-17增加，而轉(zhuǎn)染miR-150-5P inhibitor組下降，有DCs共培養(yǎng)組高于未共培養(yǎng)組，CRS患者組高于正常對照組，P<0.05，有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：miR-150-5P在CRS中的表達是上調(diào)表達，miR-150-5P mimic促進T細胞增殖和IL-17分泌，miR-150-5P inhibitor抑制

17、T細胞增殖和IL-17分泌。miR-150-5P通過DC-Th軸影響CRS發(fā)病的。
　　第四部分預(yù)測并驗證CRS患者DC中miR-150-5P可能作用的靶基因
　　目的：探討差異表達miR-150-5P可能作用的靶基因及靶蛋白，以期探討通過干預(yù)差異表達miR-150-5P對CRS疾病預(yù)防和治療的意義。
　　方法：采用生物信息學分析軟件TargetScan、PicTar、MiRanda和miRBase Targets對與

18、DC分化、成熟和功能相關(guān)的miR-150-5P靶基因進行靶點預(yù)測，通過蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western blot，WB）驗證靶蛋白，通過熒光素酶報告試驗，將靶蛋白3’UTR區(qū)域克隆至含蟲熒光素酶報告基因3’UTR區(qū)，同時合成miR-150-5P片段將二者共轉(zhuǎn)染HEK293細胞(1x104)，孵育48h后，對熒光素酶活性進行檢測，驗證該靶基因是否為miR-150-5P的靶基因。
　　結(jié)果：通過生物學軟件預(yù)測早期生長反應(yīng)蛋白2（ea