刺五加胚性細胞團形成差異表達基因的篩選及克隆.pdf

1、刺五加(Eleutherococcus senticosus Maxim)是珍貴的藥用植物,由于不合理采摘,野生刺五加數(shù)量急劇減少,已被列入保護植物。對刺五加進行人工培育、擴繁,是滿足人們需求的主要途徑,而建立高效的刺五加體細胞發(fā)生體系則是實現(xiàn)這一目的最為有效的方法。體細胞胚發(fā)生是一個復(fù)雜的過程,應(yīng)用分子生物學手段對這一發(fā)生機制進行研究是十分有必要的,這對更好地保護這一珍貴物種具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 本文以刺五加的胚性細胞團

2、和非胚性細胞團為材料,對以胚性細胞團方式產(chǎn)生的體細胞胚相關(guān)基因進行了研究。對前期做過的基因芯片結(jié)果進行歸類分析,從中挑選差異倍數(shù)較顯著且與體胚發(fā)生相關(guān)的基因進行定量PCR差異表達分析,結(jié)果表明,在選擇的上調(diào)基因中,有一個基因在定量結(jié)果中表現(xiàn)為下調(diào),其余的所有基因的表達差異結(jié)果均與芯片結(jié)果相同。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)其余上調(diào)基因均與體細胞胚發(fā)生有直接或間接的相關(guān)性,由于工作量過大,所以首先選擇了其中三個基因進行RACE克隆分析,并將它們分別命

3、名為EsAP21,、EsXET1、EsPT1。EsAP21基因全長為2033bp,編碼549個氨基酸,同源性分析結(jié)果顯示,該基因與擬南芥等物種PLT基因具有高度同源性,具有AP2/EREBP家族保守序列；EsXET1基因全長1102bp,編碼290個氨基酸,多序列比對顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)與多物種的木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶具有高度同源性,屬于糖基水解酶16家族；EsPT1基因全長1965bp,編碼528個氨基酸,同源性比對結(jié)果顯示該基因編碼

4、的蛋白與磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白有很高的同源性,屬于MFS超家族。結(jié)果表明,這三個基因分別在體細胞胚發(fā)生的不同時期上調(diào)表達,對細胞生長發(fā)育以及胚胎發(fā)生、細胞壁重建和磷酸鹽的運輸起重要的作用,推測在刺五加胚性細胞的發(fā)生及發(fā)育過程中這些基因協(xié)調(diào)表達,其中EsAP21基因起決定性作用。同時應(yīng)用透射電子顯微鏡對1/3MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的刺五加胚性細胞團和非胚性體細胞胚進行超微結(jié)構(gòu)觀察,對比結(jié)果表明胚性細胞具有豐富的細胞內(nèi)含物,淀粉粒多,細胞壁厚,核質(zhì)比大