可示蹤的防齲基因疫苗構(gòu)建、表達(dá)及其基因疫苗PELA微球的研究.pdf

1、該研究將微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物材料學(xué)等多學(xué)科有機(jī)結(jié)合起來,運(yùn)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了可示蹤的防齲基因疫苗;對可生物降解材料作為防齲基因疫苗釋放系統(tǒng)進(jìn)行了研究;并對防齲基因疫苗在體內(nèi)外的表達(dá)以及不同方式免疫的BALB/C小鼠的特異性抗體進(jìn)行了檢測.通過GFP的指示作用及免疫組化方法,對防齲基因疫苗在體內(nèi)外的表達(dá)進(jìn)行初步的示蹤研究,為防齲基因疫苗的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).該研究共包括四個部分.第一,該研究構(gòu)建了以綠熒光蛋白基因作為報告基因

2、的可示蹤的防齲基因疫苗.利用PCR方法,擴(kuò)增變異鏈球菌(Streptococci mutans,S.mutans)MT8148菌株表面蛋白抗原PAC氨基端的基因片段pac-A(1.3Kb).PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1雙酶切,并回收相應(yīng)DNA片段后,采用DNA連接試劑盒進(jìn)行連接重組,轉(zhuǎn)化.轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定,獲得了4.7Kb與1.3Kb兩個片段;重組質(zhì)粒中插入基因的序列測定表明,該插入序列與pac全基因的314-

3、1630bP的核酸序列完全相同,插入基因的兩側(cè)分別與Kpn I和Apa I酶切位點(diǎn)的序列一致,插入基因的上游有起始密碼子,下游有終止密碼子.第二,為了檢測構(gòu)建的可示蹤的防齲基因疫苗能否在哺乳動物細(xì)胞中正確表達(dá)出來,將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pEGFPC1-pacA采用脂質(zhì)體Lipofectin試劑介導(dǎo)轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞.通過熒光倒置顯微鏡直接觀察和流式細(xì)胞儀測定熒光強(qiáng)度指示GFP的表達(dá);采用RT-PCR法檢測重組質(zhì)粒中pac-A基因在COS1細(xì)

4、胞中的轉(zhuǎn)錄;并用蛋白質(zhì)免疫印跡雜交(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液pac-A基因的表達(dá).第三,該實驗旨在為防齲基因疫苗尋找一種有效的釋放系統(tǒng).以聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)為材料,采用改進(jìn)的溶劑揮發(fā)法雙乳液(W1/O/W2)體系制備DNA/PELA復(fù)合物,在掃描電鏡下觀察其形態(tài)、粒度分布儀測定平均粒徑;測定了復(fù)合物中DNA的包封率、細(xì)胞外釋放特征,及其包被對DNA結(jié)構(gòu)的影響;采用MTT法測定了PELA包被材料本身的細(xì)

5、胞毒性;并對其介導(dǎo)的DNA體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的效果進(jìn)行了檢測.結(jié)果顯示所制備的復(fù)合物多為球形,平均粒徑1.806μm;微球中DNA的包封率達(dá)78.9﹪,在細(xì)胞外具有緩釋的特征,DNA結(jié)構(gòu)沒有被破壞;PELA材料本身對細(xì)胞基本無毒性;DNA/PELA微球能在體外直接轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察到了發(fā)綠色熒光的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞;流式細(xì)胞儀測定重組質(zhì)粒DNA/PELA微球細(xì)胞組的平均熒光強(qiáng)度比陰性對照細(xì)胞組的高,但比陽性對照細(xì)胞組低;用R

6、T-PCR檢測重組質(zhì)粒陽性對照組及DNA/PELA轉(zhuǎn)染組的pac-A基因的轉(zhuǎn)錄.第四，為了進(jìn)一步證實構(gòu)建的可示蹤防齲基因疫苗的免疫學(xué)活性，以及PELA基因疫苗釋放系統(tǒng)對免疫效果的影響，我們進(jìn)行了小鼠體內(nèi)實驗.將基因疫苗裸DNA和DNA/PELA微球分別以單劑肌注，多次肌注，口服接種等方式對BALB/C小鼠進(jìn)行免疫，通過ELISA法檢測血清特異性抗體.該實驗還通過GFP的指示作用及免疫組化法對基因疫苗在實驗小鼠體內(nèi)各組織的分布進(jìn)行了示蹤研