三維石墨烯泡沫負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚傷口愈合的研究.pdf

1、研究背景
　　臨床上，炎癥、Ⅲ度燒傷、體表腫瘤切除、急性創(chuàng)傷及慢性皮膚潰瘍等，均可造成全層皮膚缺損。目前受損皮膚傷口的患病率較高，治療是困難的，往往不盡如人意，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)負(fù)面的影響。
　　皮膚傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到許多類型的細(xì)胞和過(guò)程，如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成及傷口收縮。目前臨床用于修復(fù)全層皮膚缺損的常用的方法有自體游離

2、皮片移植、皮瓣移植、異體皮/異種皮移植和人工替代物移植等方法。目前皮膚缺損的治療，臨床上還是以自體皮片移植為主，但植皮成活后在色澤、質(zhì)地、瘢痕增生、供區(qū)愈合等方面存在一定弊端，且供體皮膚數(shù)量是受限的。隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，組織工程化皮膚的應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注。目前，應(yīng)用于臨床的組織工程皮膚產(chǎn)品主要有人工表皮、人工真皮以及復(fù)合全層皮膚，但其對(duì)于傷口愈合往往存在一系列的問(wèn)題，如創(chuàng)面收縮，瘢痕形成，與宿主的整合差，早期血管形成差。移植早期缺

3、乏血管結(jié)構(gòu)，不能及時(shí)建立血運(yùn)是目前的組織工程化皮膚在臨床應(yīng)用受限、移植成功率不高的一個(gè)重要原因。特別值得關(guān)注的是，瘢痕，除了使受損組織不同程度喪失功能外，還有心理上的相關(guān)的問(wèn)題如審美的創(chuàng)傷和痛苦，顯著影響患者的生活質(zhì)量。
　　近幾年來(lái)，采用組織工程的方法，使干細(xì)胞結(jié)合生物材料基質(zhì)促進(jìn)皮膚傷口愈合的研究，已獲得越來(lái)越多的關(guān)注。然而，目前的研究存在著許多障礙，特別是如何采取合適的途徑誘導(dǎo)皮膚再生同時(shí)避免瘢痕，促進(jìn)血管形成。骨髓間充質(zhì)干

4、細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)已被報(bào)道在改善傷口的愈合方面具有重大的作用，其積極參與傷口的不同階段愈合。BMSCs參與炎癥的衰減調(diào)節(jié)過(guò)程，提高促血管生成因子分泌作用，重塑宿主的免疫，介導(dǎo)傷口愈合的細(xì)胞功能發(fā)揮，有利于組織再生和抑制纖維組織的形成。因而，BMSCs已被認(rèn)為在細(xì)胞治療方面是一個(gè)具有很大潛力的重要的成員，其在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)能減少瘢痕形成，提高創(chuàng)面血管

5、化。
　　生物材料支架是組織工程研究的橋梁，為細(xì)胞的增殖分化、營(yíng)養(yǎng)交換、新陳代謝等生理活動(dòng)提供必需的空間場(chǎng)所，在組織的構(gòu)建過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此，生物材料支架的優(yōu)劣，不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效果，而且決定著細(xì)胞移植后能否很好的適應(yīng)、結(jié)合宿主，從而影響到受損皮膚最終的修復(fù)效果。
　　石墨烯泡沫(graphene foam，GF)，具有三維多孔結(jié)構(gòu)，最近在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。三維石墨烯泡沫(three-d

6、imensional graphene foam，3D-GFs)，具有單層連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)。有報(bào)道研究表明，3D-GFs的孔隙率高達(dá)99.5±0.2％，具有100至300μm的孔徑，可能具有較高的傷口的水分保持能力。因此，該3D-GFs結(jié)構(gòu)是一種很有前途的候選細(xì)胞支架，因?yàn)樗赡芸偤闲螤?、化學(xué)和電學(xué)的特性在同一支架中的發(fā)揮作用，為皮膚組織再生提供一個(gè)適宜的環(huán)境，優(yōu)于傳統(tǒng)的惰性生物材料。研究證實(shí)二維石墨烯的獨(dú)特性質(zhì)可誘導(dǎo)干細(xì)胞優(yōu)先分化為特定

7、的譜系，3D-GFs亦可作為具有生物相容性的導(dǎo)電支架，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的分化增殖，且能誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。引起臨床興趣的是，3D-GFs能在體外促使細(xì)胞增殖與分化，其多孔三維結(jié)構(gòu)可提供三維微環(huán)境，能模擬細(xì)胞體內(nèi)皮膚傷口愈合過(guò)程。此外，在傷口感染治療方面，石墨烯材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌和抗真菌作用。石墨烯泡沫的上述特性，為選擇其作為組織工程細(xì)胞支架提供了新的治療思路。
　　在這項(xiàng)研究中，我們假設(shè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與石墨烯泡沫的生物力學(xué)和

8、生化特征協(xié)同，能改善創(chuàng)傷愈合環(huán)境，促進(jìn)早期血管形成和減少瘢痕?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯繉拇笫蠊撬杼崛￠g充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)進(jìn)行分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，以3D-GFs做為細(xì)胞支架，負(fù)載BMSCs，移植到皮膚受損創(chuàng)面，進(jìn)行創(chuàng)面愈合、血管化和瘢痕的研究。
　　研究目的
　　檢測(cè)3D-GFs支架的生物相容性;觀察3D-GFs和BMSCs在創(chuàng)面愈合中作用;并進(jìn)一步觀察3D-GFs和BMSCs

9、在創(chuàng)面血管化和減輕瘢痕方面的效應(yīng);最終為皮膚傷口治療提供新的思路和途徑，為其在組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.取成年雄性SD大鼠股骨、脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞，采用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行分離培養(yǎng)擴(kuò)增。取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物CD54、CD73、CD45和CD34表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行成脂、成骨能力檢測(cè)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并進(jìn)一步使用油紅染色、茜素紅染色觀察定向誘導(dǎo)的效果。
　

10、　2.采用化學(xué)氣相沉積法合成3D-GFs，使用掃描電顯微鏡和金相顯微鏡觀察樣品表面形貌，能譜儀和拉曼光譜儀，進(jìn)一步進(jìn)行樣品材料成分分析。
　　3.將大鼠BMSCs分別接種于3D-GFs、聚苯乙烯基板(Tissue CulturePolystyrene，TCPS)，使用MTT法、LDH法、BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。并同時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)大鼠BMSCs在3D-GFs上生長(zhǎng)情況。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　將體重220

11、-300g的雄性SD大鼠隨機(jī)平均分為三組:對(duì)照組、GF組和GF加MSCs組。在大鼠背部制造全層皮膚缺損切口，所有傷口均用透明敷料覆蓋，并使用彈性繃帶加以固定。將動(dòng)物關(guān)在單獨(dú)的籠子里，允許自由采食，每天觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的創(chuàng)面變化。術(shù)后第3d、7、10和14d，采用CO2吸入法處死大鼠，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)VEGF、bFGF、TGF-β1，TGF-β3，α-SMA的表達(dá);術(shù)后14d，行HE染色組織學(xué)染色檢測(cè)再生皮膚厚度;術(shù)后7、14d進(jìn)行各

12、組再生皮膚可溶性膠原含量的測(cè)定。待各組皮膚傷口愈合后，取新愈合皮膚進(jìn)行水化作用、經(jīng)皮水分流失、抗拉力強(qiáng)度和彈性位移測(cè)定。
　　結(jié)果
　　1.采用全骨髓培養(yǎng)法成功分離出BMSCs，第5d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，以梭形細(xì)胞為主，生長(zhǎng)旺盛，連續(xù)傳代4代，未見有細(xì)胞明顯衰退。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)CD54、CD73，其陽(yáng)性率分別為98％和97％;而造血干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD45、CD34陽(yáng)性率僅為1％、1.5％。成脂、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)

13、后，油紅染色、茜素紅染色均為陽(yáng)性。
　　2.采用化學(xué)氣相沉積法成功合成了3D-GFs，掃描電鏡和金相顯微鏡觀察，其具有單層連續(xù)多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為99.7±0.3％，孔徑大小100-350μm，骨架寬度40-100μm。拉曼光譜儀測(cè)定結(jié)果確定合成的GF含有單層和少層的石墨烯，能譜儀測(cè)試結(jié)果表明GF的表面碳為主要元素，未能明顯測(cè)出鎳元素。
　　3.MTT法和LDH法檢測(cè)表明，與TCPS相比，3D-GFs對(duì)大鼠BMSCs的增殖無(wú)顯

14、著性差異（P＞0.05）。BrdU摻入法結(jié)果分析表明，從第5d開始，3D-GFs對(duì)大鼠BMSCs增殖活力顯著高于TCPS(P＜0.01)。同時(shí)免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示大鼠BMSCs在3D-GFs具有良好的細(xì)胞粘附，能形成三維網(wǎng)絡(luò)。
　　4.傷口面積和愈合時(shí)間分析顯示，GF組與對(duì)照組的創(chuàng)面愈合比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。移植后3d，與其他2組相比，GF加MSCs組傷口面積明顯縮小(P＜0.01)，傷口愈合時(shí)間亦明顯縮短(P＜0

15、.01)。血管化VEGF和bFGF的mRNA水平檢測(cè)顯示GF組與對(duì)照組相比，沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異（P＞0.05）;從3d到14d，GF加MSCs組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)和GF(P＜0.01)組。GF加MSCs組TGF-β1水平與其它2組相比明顯降低(P＜0.01)。TGF-β3的表達(dá)在3組是一個(gè)相反的趨勢(shì)，并在GF加MSCs組的表達(dá)水平明顯高于其他2組(P＜0.01)。α-SMAmRNA水平隨著時(shí)間的推移，與TGF-β1的表達(dá)

16、水平調(diào)節(jié)趨勢(shì)相似。GF組TGF-β1(從10d)，TGF-β3(從第10d)，和α-SMA(從7d)與對(duì)照組相比，存在顯著性差異（P＜0.05）。皮膚厚度、可溶性膠原含量、抗拉力強(qiáng)度和彈性位移測(cè)定，GF加MSCs組表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05)和GF組(P＜0.01或P＜0.05)，GF組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。水化作用、經(jīng)皮水分流失測(cè)定，GF加MSCs組優(yōu)于GF組(P＜0.01或P＜0.05)和對(duì)照

17、組(P＜0.01)，GF組優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.全骨髓貼壁培養(yǎng)法可成功分離擴(kuò)增大鼠BMSCs，表達(dá)MSCs表面抗原，具有多項(xiàng)分化潛能。
　　2.采用化學(xué)氣相沉積法能合成的3D-GFs，其具有單層連續(xù)多孔結(jié)構(gòu)，且雜質(zhì)少，缺陷少，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
　　3.3D-GFs對(duì)BMSCs無(wú)細(xì)胞毒作用，相容性高，且能促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　4.3D-GFs負(fù)載BMSCs能上調(diào)VEGF和bFGF，促進(jìn)血管的