三種骨髓間充質干細胞移植方法對大鼠急性皮膚創(chuàng)面愈合作用的比較研究.pdf

1、急性皮膚創(chuàng)傷是非常常見的創(chuàng)傷，幾乎見于所有外科創(chuàng)傷中，包括燒傷和輻射傷等。是由于正常皮膚受到外來因素的不良作用而產生破損，暴露真皮或真皮下層組織造成的。在此類創(chuàng)傷處理中，首要任務是有效覆蓋創(chuàng)面，既要防止感染，又要防止組織液和血液滲出，同時還不引起機體的不良反應，為后續(xù)治療和創(chuàng)面愈合創(chuàng)造良好環(huán)境。然而，普通覆蓋物往往以人造材料為主，生物相容性較低，幾乎不具備促進皮膚細胞增殖和愈合的能力，越來越難以滿足愈合快速、美觀的要求，特別是頜面部血管

2、豐富皮膚的特殊美觀要求。自體植皮手術不僅給患者造成二次創(chuàng)傷，同時也受限于患者自身條件。因此，找到一種有效促進皮膚愈合，達到美觀功能要求的材料對于治療皮膚創(chuàng)傷，特別是頜面部皮膚創(chuàng)傷，具有重要價值。
　　骨髓間充質干細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs），是一種源于中胚層并具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，存在于成年動物的骨髓基質中，能夠被分離培養(yǎng)并形成克隆。BMMSCs以其

3、低抗原性、多向分化和分泌多種促血管新生因子與免疫調節(jié)因子的獨特性能，在組織修復、器官移植和再生醫(yī)學領域已有廣泛應用。目前，主要應用途徑包括靜脈注射和在損傷部位周圍局部注射BMMSCs，分別利用血液輸送和趨化過程使BMMSCs到達創(chuàng)傷部位發(fā)揮修復作用。BMMSCs在某些炎性刺激后能分泌抑制過度炎癥的因子和促血管化、成纖維細胞生長遷移的因子被認為是其促進創(chuàng)傷愈合的主要機制。
　　細胞膜片技術是近年來出現(xiàn)的，以不使用胰酶消化而獲得大量可

4、供移植的細胞為特點的技術。細胞在特殊培養(yǎng)基誘導下依靠自身分泌的細胞外基質相連接成片狀，并可用機械力或應用熱敏材料將其從固相表面剝離。這為BMMSCs等一類擁有優(yōu)良性質的細胞提供了一種全新的移植方式，避免了酶消化帶來的細胞損失，使得移植細胞的性質能夠最大限度的保留和發(fā)揮。目前，BMMSCs膜片已在骨折修復、牙周膜修復等多個領域成功應用，但用于皮膚損傷修復卻未見報道。本實驗采用大鼠來源的BMMSCs體外培養(yǎng)，經鑒定后構建BMMSCs膜片，旨

5、在驗證BMMSCs膜片移植與細胞懸液注射法在修復典型的全層皮膚損傷時，修復效果和具體機制上的區(qū)別，進而歸納出發(fā)揮BMMSCs促愈合功能的最佳途徑，為今后臨床上應用BMMSCs修復皮膚急性損傷提供實驗依據(jù)。
　　研究目的:
　?。?）驗證體外穩(wěn)定構建SD大鼠BMMSCs膜片的方法，并探討B(tài)MMSCs膜片（BMMSCs-sheet）的形態(tài)學特點和分泌細胞外因子時的特殊性質；
　?。?）構建大鼠背部急性全層皮膚創(chuàng)傷模型，并采

6、用細胞膜片（BMMSCs-sheet, B-sheet）、靜脈注射（intravenous-injection, int-in）和創(chuàng)面周圍局部注射BMMSCs（local-injection, loc-in）三種方式移植BMMSCs，探討和比較三組模型的創(chuàng)面愈合情況、血管化情況、和炎癥情況；
　?。?）比較三種移植方式的細胞在創(chuàng)面存活及對炎癥狀況的影響，探討B(tài)MMSCs-sheet促進創(chuàng)傷愈合的主要機制。
　　研究方法:

7、r>　?。?）采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)熒光SD大鼠（GFP-SD Rats）骨髓間充質干細胞（GFP-BMMSCs）。并用流式細胞技術鑒定表面分子、繪制生長曲線、誘導多向分化等方式進行干細胞特性驗證。
　?。?）采用手術剪除的方法建立普通大鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型，并將模型分為三組，分別移植成功培養(yǎng)的GFP-BMMSCs-sheet，尾靜脈注射以及創(chuàng)面局部注射相同細胞量的GFP-BMMSCs。同時在每一組設置陰性對照。
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8、3）分別在不同時間點（1,2,4,6-week）取材，收集創(chuàng)面愈合大小和血管化的直觀形態(tài)學資料。
　?。?）對創(chuàng)面組織切面后進行蘇木精–伊紅（HE）和馬森三色染色，收集不同移植組創(chuàng)面組織炎癥狀況、真皮改建和膠原積累狀況、附屬器發(fā)育狀況等并量化對比。
　?。?）采用免疫熒光染色檢測創(chuàng)面存活的GFP-BMMSCs和免疫細胞，并量化數(shù)據(jù)，找出相互關聯(lián)。
　?。?）提取創(chuàng)面新生組織的RNA，反轉錄后進行RT-PCR，對比不同移

9、植組見相關炎性因子、促血管新生因子、免疫調節(jié)因子和膠原蛋白等表達情況。
　　研究結果：
　?。?）分離培養(yǎng)的GFP-BMMSCs表達正常的間充質干細胞表面標志，不表達造血系統(tǒng)來源細胞表面標志，并具有克隆形成能力。茜素紅、油紅染色顯示所培養(yǎng)的BMMSCs能夠被誘導向成骨細胞、脂肪細胞方向分化。傳代后GFP-BMMSCs在熒光顯微鏡下有明顯熒光。
　　（2）成功大鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型，大鼠正常存活，無全身性不良反應和嚴重

10、感染發(fā)生。
　?。?）三種移植方法在愈合的1周和2周時（炎癥反應期和增殖-遷移-收縮期）創(chuàng)面面積無明顯差異。但在4周時三組創(chuàng)面面積顯著小于各自對照組；B-sheet組創(chuàng)面面積明顯小于int-in和loc-in兩組，后兩組間無顯著差異；各對照組間也無明顯差異。4周時，B-sheet組大鼠愈合皮膚血管化程度顯著高于其他兩組，后兩組間無顯著差異，對照組間無差異。
　?。?） HE染色和馬森染色顯示B-sheet組愈合皮膚組織4周炎

11、癥細胞浸潤狀況低于int-in和loc-in組，規(guī)則膠原積累程度和膠原密度均高于后兩組。
　?。?）移植后4周，B-sheet組新生組織中表達GFP的細胞存活量顯著高于int-in組和loc-in組，同時CD68陽性細胞數(shù)也多于后兩組，CD45陽性細胞數(shù)則顯著低于后兩組。移植后4周，B-sheet組新生組織中炎性因子表達量顯著低于int-in組和loc-in組以及對照組，促成纖維細胞生長因子和粗血管新生因子顯著高于量注射組及對照組

12、。
　　研究結論：
　?。?）體外培養(yǎng)的大鼠BMMSCs可在誘導下形成細胞膜片，膜片有一定的強度和韌性，并能用機械力刮下。
　?。?） BMMSCs-sheet表達多種促進愈合的細胞因子和蛋白。移植全層皮膚創(chuàng)面后，BMMSCs-sheet能促進創(chuàng)面愈合及血管化，效果優(yōu)于靜脈注射和創(chuàng)面局部注射。
　?。?） BMMSCs-sheet能降低創(chuàng)傷后炎癥反應強度，促進真皮基質較快較規(guī)則的沉積，效果優(yōu)于靜脈注射和創(chuàng)面局部注