5-脂氧合酶在神經(jīng)細(xì)胞損傷中作用的研究.pdf

1、該研究中,我們采用轉(zhuǎn)染5LO的策略,研究神經(jīng)細(xì)胞5LO功能,觀察內(nèi)源性表達(dá)5LO是否影響PC12細(xì)胞增殖、分化,是否影響細(xì)胞對一些致AD損傷因素如淀粉樣蛋白、無營養(yǎng)因子等的反應(yīng)性:1.將HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)插入質(zhì)粒pBI-G的多克隆位點(diǎn)中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克隆入該載體的HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)插入質(zhì)粒pBI-G的多克隆位點(diǎn)中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)插入質(zhì)粒pBI-G的多

2、克隆位點(diǎn)中,再將PCR獲得的5LO cDNA全序列克隆入載體的HindⅢ和Sa/I位點(diǎn)獲得誘導(dǎo)表達(dá)載體pBI-5LO.采用酶切分析及測序驗(yàn)證,對獲得的載體進(jìn)行確證.2.采用報(bào)告基因β-半乳糖苷酶組化染色的方法,在PC12細(xì)胞模型上對5LO Tet-On誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行工作測試,加入誘導(dǎo)劑多西環(huán)素1μg/ml孵育48h后,對細(xì)胞進(jìn)行染色,陽性細(xì)胞被染為亮蘭色,表明該誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在PC12細(xì)胞上能夠工作.3.誘導(dǎo)表達(dá)載體pBI-5LO采用F

3、uGENE 6試劑轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞,潮霉素50μg/ml加壓篩選分離克隆,以測定報(bào)告基因β-半乳糖苷酶活生的方法進(jìn)行初篩,然后用RT-PCR測定5LO mRNA Western blot測定5LO蛋白、反相HPLC測定5LO活性的方法進(jìn)行確證,獲得5LO誘導(dǎo)表達(dá)PC12細(xì)胞.4.采用綠熒光蛋白和5LO的融合研究5LO在PC12細(xì)胞的亞細(xì)胞定位,融合蛋白與核染料Hoechst33258共定位,表明5LO在PC12細(xì)胞可分布于細(xì)胞核內(nèi).5.

4、采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT法測定細(xì)胞增殖、NGF(200U/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞分化等方法,發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下5LO誘導(dǎo)表達(dá)對PC12細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化沒有明顯影響.6.采用臺盤蘭染色、MTT法、流式細(xì)胞儀等測定細(xì)胞死亡.淀粉樣蛋白肽Aβ25-35(5μM)孵育48h,與對照相比,5LO誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞死亡率顯著增加;無血清培養(yǎng)48h,5LO表達(dá)細(xì)胞死亡率顯著高于對照組;NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化7d后,撤除NGF后48h,5L

5、O表達(dá)也顯著增加細(xì)胞的死亡率.7.采用測定細(xì)胞上清LDH活性的方法測定細(xì)胞損傷.5LO抑制劑AA861(5μM)、MK886(5μM)均能顯著抑制Aβ25-35(5μM)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷.8.采用生化法測定超氧化物酶(SOD)、過氧化氫酶(Cat)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),MDA法測定脂質(zhì)過氧化,DCF熒光法測定過氧化物水平,Ac-DEVD-AMC底物熒光法測定Caspase-3活性,RT-PCR方法測定凋亡相關(guān)基因的表達(dá).5