Nrf2在液壓沖擊腦損傷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:觀察Nrf2基因敲除小鼠液壓沖擊腦損傷后水腫腦組織中凋亡蛋白Casepase-3、Casepase-12表達(dá)變化和神經(jīng)細(xì)胞凋亡改變，探討Nrf2在液壓沖擊腦損傷中所發(fā)揮的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。
　　方法:用雄性Nrf2基因正常和基因敲除小鼠制作液壓沖擊腦損傷模型。選取成年小鼠32只，其中Nrf2+/+、Nrf2-/-各16只，體重約28-32g，隨機(jī)分為4組:Nrf2+/+對照組(Nrf2+/+NC組，n=8)、Nrf2+/+

2、損傷組(Nrf2+/+TBI組，n=8)和Nrf2-/-對照組(Nrf2-/-NC組，n=8)、Nrf2-/-損傷組(Nrf2-/-TBI組，n=8)。其中，對照組僅頭顱開窗不進(jìn)行液壓沖擊損傷;損傷組頭顱開窗并常規(guī)制作液壓沖擊腦損傷模型。
　　各實(shí)驗(yàn)組小鼠于24h后采用神經(jīng)功能缺損評分(NSS)方法進(jìn)行評分，然后過度麻醉，斷頭，留取組織標(biāo)本。迅速從損傷區(qū)前緣取重約50mg水腫腦組織，采用干濕重法測量腦組織含水量;經(jīng)損傷區(qū)切成約4m

3、m薄層冠狀腦組織，用多聚甲醛固定，采用HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化;免疫組織化學(xué)染色方法檢測Caspase-3、Caspase-12的表達(dá);原位末端熒光標(biāo)記(TUNEL)法檢測神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況;取損傷區(qū)域后緣腦組織采用免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測Caspase-3、Caspase-12蛋白含量。
　　結(jié)果:
　　1神經(jīng)功能缺損評分
　　腦損傷后，小鼠出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損癥狀。與對照組(NC)比較，損傷各

4、組(TBI)在損傷后24h神經(jīng)功能評分明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;但是Nrf2+/+TBI組（5.25±0.89）與Nrf2-/-TBI組（5.88±1.36）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2組織學(xué)觀察
　　Nrf2+/+NC組和Nrf2-/-NC組肉眼觀察:腦組織軟腦膜完整表面光滑，腦溝及腦回清晰可見，腦表面及顱底無挫傷、出血、充血等表現(xiàn)。鏡下觀察:腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序，核膜完整，核

5、仁藍(lán)色淡染。
　　Nrf2+/+TBI組和Nrf2-/-TBI組肉眼觀察:可見打擊側(cè)皮層局部挫傷，腦溝回存在積血，切面觀察可見皮層下有散在點(diǎn)狀出血，嚴(yán)重者可見腦室內(nèi)出血。鏡下觀察:挫傷灶周圍細(xì)胞出現(xiàn)水腫且水腫程度明顯，胞漿淡染，部分出現(xiàn)空泡樣變性伴膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　3腦組織含水量測定
　　采用Elliot公式對小鼠腦組織含水量進(jìn)行測定。與對照組相比，損傷各組小鼠腦組織含水量明顯增高;Nrf2+/+NC組（78.37±

6、0.18）與Nrf2-/-NC組（78.32±0.13）比較無差別（P＞0.05），Nrf2+/+TBI組(81.55±0.40)與Nrf2-/-TBI組（82.89±0.20）之間有明顯差別(P＜0.05)。
　　4免疫組化技術(shù)檢測Caspase-3和Caspase-12表達(dá)
　　Nrf2+/+NC組和Nrf2-/-NC組小鼠Caspase-3和Caspase-12陽性細(xì)胞很少，Nrf2+/+TBI組和Nrf2-/-TBI

7、組小鼠則明顯增多。與Nrf2+/+NC組比較，Nrf2+/+TBI組動(dòng)物挫傷灶周圍腦組織內(nèi)Caspase-3（28.892±5.865），Caspase-12(28.619±2.547)陽性細(xì)胞明顯增多，且染色也較深(P＜0.05);與Nrf2-/-NC組比較，Nrf2-/-TBI組動(dòng)物挫傷灶周圍腦組織內(nèi)Caspase-3（56.884±5.819），Caspase-12（51.196±4.563）陽性細(xì)胞數(shù)量增多，且染色也加深(P＜0

8、.05);與Nrf2+/+TBI組相比，Nrf2-/-TBI組動(dòng)物挫傷灶周圍腦組織Caspase-3，Caspase-12陽性細(xì)胞同樣明顯增多(P＜0.05)。
　　5 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　Nrf2+/+NC組和Nrf2-/-NC組TUNEL陽性細(xì)胞很少，Nrf2+/+TBI組和Nrf2-/-TBI組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)均較對照組明顯增多，且Nrf2-/-TBI組（59.30±9.90）明顯高于Nrf2+/+

9、TBI組（31.11±5.31），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6 Western Blot測定Caspase-3和Caspase-12蛋白表達(dá)情況
　　Nrf2+/+NC組和Nrf2-/-NC組小鼠Caspase-3和Caspase-12蛋白表達(dá)較少，但Nrf2+/+TBI組和Nrf2-/-TBI組小鼠表達(dá)明顯增多。與Nrf2+/+NC組比較，Nrf2+/+TBI組動(dòng)物挫傷灶周圍腦組織內(nèi)Caspase-3（0.88

10、57±0.0226），Caspase-12（0.6327±0.0080）明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與Nrf2-/-NC組比較，Nrf2-/-TBI組動(dòng)物挫傷灶周圍腦組織內(nèi)Caspase-3（1.0894±0.2479），Caspase-12（1.0290±0.1421）也明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與Nrf2+/+TBI組相比，Nrf2-/-TBI組動(dòng)物挫傷灶周腦組織的Caspase-3，Caspase

11、-12蛋白表達(dá)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1野生型(Nrf2+/+)小鼠液壓沖擊腦損傷后水腫腦組織內(nèi)Caspase-3和Caspase-12表達(dá)增多，神經(jīng)細(xì)胞凋亡加重，提示液壓沖擊腦損傷后Caspase-3和Caspase-12上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　2液壓沖擊傷后Nrf2基因敲除型(Nrf2-/-)小鼠腦損傷后Caspase-3和Caspase-12表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯高