可回復(fù)永生化人胎肝細(xì)胞系的建立及其移植預(yù)防小鼠急性肝衰竭.pdf

1、背景和目的：
　　 急慢性肝衰竭是病毒性肝炎等各種病因?qū)е碌慕K末期肝病。目前雖然原位肝移植仍是治愈終末期肝衰竭的惟一方法，但肝移植費(fèi)用很高，技術(shù)復(fù)雜，最關(guān)鍵的是受到供肝不足的限制。生物人工肝和肝細(xì)胞移植療法可暫時輔助或部分代替嚴(yán)重病變的肝臟功能，清除體內(nèi)各種有害物質(zhì)，代償肝臟相應(yīng)的功能，從而使肝細(xì)胞得以再生直至自體肝臟功能恢復(fù)或等待機(jī)會進(jìn)行肝移植，已成為替代肝移植和等待肝移植過渡治療的極具吸引力的選擇。但是，生物人工肝和肝細(xì)胞移

2、植的臨床應(yīng)用同樣受到肝細(xì)胞來源缺乏的限制。因?yàn)橛糜谏锶斯じ渭案渭?xì)胞移植的理想肝細(xì)胞應(yīng)具有以下特征：①人源性；②表型正常；③易于獲得；④易于培養(yǎng)且能迅速生長至高密度；⑤具有良好的分化狀態(tài)及成熟肝細(xì)胞的全部生物代謝功能。理論上，人原代肝細(xì)胞是最理想的細(xì)胞材料，但由于成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植，加之成人肝細(xì)胞在體外增殖能力差，故大量獲得成人肝細(xì)胞是不可能的。胎肝的利用因涉及倫理問題且同樣來源受限，亦無法滿足臨床需要。使用動物肝細(xì)胞又

3、存在發(fā)生免疫反應(yīng)及傳播動物病毒的危險。因此上述兩種治療方法在很大程度上依賴于人肝細(xì)胞系的發(fā)展。原代肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)不但難以增殖傳代，而且在一兩周內(nèi)迅速失去原有的肝細(xì)胞代謝功能。通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將猿猴病毒40大T抗原(simian virus40 large T antigen，SV40T)等具有永生化作用的基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中并穩(wěn)定表達(dá)，可使細(xì)胞獲得永生化同時保留一定的原代細(xì)胞特性。目前肝細(xì)胞永生化成為解決肝細(xì)胞來源的重要途徑之一。本研究目的

4、是應(yīng)用攜帶SV40T基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCTIGlox轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人胎肝細(xì)胞，建立永生化人胎肝細(xì)胞系，并對該細(xì)胞系的功能特性，永生化細(xì)胞的可回復(fù)性以及脾內(nèi)移植預(yù)防90％肝切除小鼠肝衰竭的效果進(jìn)行研究。
　　 方法：
　　 1.用含新霉素耐藥基因(NeoR)、SV40T和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCTIGlox轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PT67，獲取病毒上清。用NIH3T3細(xì)胞滴定病毒滴度，免疫細(xì)

5、胞化學(xué)染色檢測上清感染的NIH3T3細(xì)胞中SV40T表達(dá)功能。
　　 2.體外兩步灌流法分離孕20周齡人胎肝細(xì)胞，常規(guī)單層培養(yǎng)原代人胎肝細(xì)胞。
　　 3.用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCTIGlox病毒上清感染原代培養(yǎng)的人胎肝細(xì)胞，用G418選擇性培養(yǎng)，篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的永生化細(xì)胞系。
　　 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測肝細(xì)胞特征蛋白的表達(dá)和SV40T蛋白的表達(dá)；糖原染色實(shí)驗(yàn)檢測肝糖原合成情況；細(xì)胞計數(shù)法測定永生化細(xì)胞的增殖

6、特性，繪制生長曲線。
　　 5.用放射免疫法和自動生化分析儀分別檢測永生化細(xì)胞的白蛋白和尿素合成。
　　 6.用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析永生化細(xì)胞的肝細(xì)胞功能相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。
　　 7.將4×106永生化細(xì)胞移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠左腋下皮下，相同胎肝細(xì)胞移植到對側(cè)作為對照，長期觀察其是否形成腫瘤。
　　 8.采用90％肝切除術(shù)制備急性肝衰竭小鼠模型，小鼠分為4組：G1

7、組經(jīng)脾移植106永生化細(xì)胞，G2組移植106原代胎肝細(xì)胞，G3組移植106 HepG2細(xì)胞，G4組注射0.1ml DMEM。通過檢測血氨和觀察細(xì)胞移植后小鼠存活情況，評價永生化細(xì)胞移植對急性肝衰竭的治療作用。
　　 9.用含Cre重組酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pQCXIP-NLS-iCre-ERT2轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix A，產(chǎn)生病毒上清轉(zhuǎn)導(dǎo)永生化細(xì)胞，建立含Cre-ERT2基因的可回復(fù)細(xì)胞系。
　　 10.用4-羥基-他

8、莫昔芬(OHT)誘導(dǎo)Cre-ERT2重組酶活性，切除SV40T基因，免疫細(xì)胞化學(xué)染色和PCR法檢測含Cre-ER基因的可回復(fù)永生化細(xì)胞受OHT誘導(dǎo)回復(fù)前后SV40T基因的表達(dá)和在基因組的整合情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIGlox轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞的病毒上清測得滴度為3×104CFU/ml。病毒上清感染的NIH3T3細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示SV40T陽性，表明pLNCTIGlox逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可

9、成功轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)SV40T基因。
　　 2.體外兩步灌流法分離孕20周齡人胎肝細(xì)胞，臺盼藍(lán)排斥法檢測細(xì)胞活力約95％，分離出的肝細(xì)胞總數(shù)高達(dá)109個。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染人原代胎肝細(xì)胞后用500μg/ml的G418篩選，連續(xù)選擇培養(yǎng)14天獲得5個具有G418抗性的具有上皮表型的細(xì)胞集落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后表型最接近原代肝細(xì)胞的1個細(xì)胞系命名為HepCL。
　　 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測HepCL肝細(xì)胞特征蛋白的

10、表達(dá)，結(jié)果A1b、CK18、CK19和SV40T均為陽性，前三者胞漿著色，后者定位于胞核。糖原染色結(jié)果弱陽性。從細(xì)胞生長曲線計算出細(xì)胞系培養(yǎng)第十代的群體倍增時間約為0.7天。
　　 5.用特異性人白蛋白放射免疫試劑檢測HepCL細(xì)胞培養(yǎng)上清中人白蛋白含量，生化儀檢測其尿素氮含量，計算出HepCL細(xì)胞系平均白蛋白和尿素合成量分別為3.6pg/cell/d和0.22pmol/cell/d。
　　 6.永生化細(xì)胞系HepCL成

11、瘤試驗(yàn)：連續(xù)觀察16個月之久，在試驗(yàn)和對照側(cè)移植處未見任何腫瘤形成。
　　 7.RT-PCR結(jié)果顯示HepCL細(xì)胞表達(dá)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異的白蛋白、細(xì)胞角蛋白CK8、CK18、肝細(xì)胞生長因子(HGF)受體、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、細(xì)胞色素P4501B1(CYP450181)和膽管上皮細(xì)胞特異的CK7、CK19、膽汁糖蛋白、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子八聚體結(jié)合蛋白4(Oct-4)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21也有表達(dá)。不表達(dá)

12、轉(zhuǎn)化生長因子受體Ⅱ型(TGF-βRⅡ)和Rex-1。
　　 8.急性肝衰竭SCID小鼠細(xì)胞移植結(jié)果顯示：G1組(移植HepCL)和G2組(移植胎肝細(xì)胞)較G3組(移植HepG2細(xì)胞)和G4組(注射DMEM)受體小鼠的生存率大大提高；血氨水平顯著降低；細(xì)胞移植兩周后，在移植HepCL細(xì)胞和原代人胎肝細(xì)胞的小鼠肝內(nèi)可觀察到人白蛋白特異性染色陽性的肝細(xì)胞群。
　　 9.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NLS-iCre-ERT2質(zhì)粒

13、DNA轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix A，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)病毒上清的細(xì)胞系，用HepG2細(xì)胞測得其病毒滴度為5x104CFU/ml。
　　 10.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NLS-iCre-ERT2轉(zhuǎn)導(dǎo)HepCL細(xì)胞獲得穩(wěn)定整合Cre-ER?；虻腃re.HepCL細(xì)胞系。
　　 11.OHT誘導(dǎo)Cre-HepCL細(xì)胞系后，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測SV40T抗原，結(jié)果回復(fù)后細(xì)胞中仍有少數(shù)細(xì)胞有表達(dá)，Cre-HepCL

14、細(xì)胞基因組仍可用PCR檢測到SV40T基因存在，Cre-HepCL細(xì)胞未能100％回復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCTIGlox轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人胎肝細(xì)胞并使之表達(dá)SV40T基因，成功建立了具有肝細(xì)胞表型的永生化人胎肝細(xì)胞系HepCL。
　　 2.實(shí)驗(yàn)顯示HepCL兼具肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)特征，表達(dá)白蛋白、細(xì)胞角蛋白CK8、18、7、19，HGF受體、AAT、CYP4501B1、GGT和