利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建可逆性永生化人牙囊細(xì)胞系的研究.pdf

1、目的：牙囊是包裹在發(fā)育牙胚表面的結(jié)締組織，牙囊將發(fā)育成為牙周的相關(guān)組織和結(jié)構(gòu)。牙囊細(xì)胞是存在牙囊中的細(xì)胞，其已被證明在體內(nèi)體外均具有多向分化潛能。但牙囊細(xì)胞存在組織來源有限，組織中細(xì)胞含量少，細(xì)胞在體外增殖困難等特點(diǎn)。因此如何有效的獲得足夠量的細(xì)胞、并保持細(xì)胞生物學(xué)特性的一致性和穩(wěn)定性，是組織工程中急待解決的問題。永生化作為獲得細(xì)胞系的重要手段在組織工程中已廣泛應(yīng)用。但以往的永生化方法存在永生化效率低、有潛在安全隱患等問題。PiggyB

2、ac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)與傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)染方法相比，具有操作簡便、效率高、整合位點(diǎn)易確定、轉(zhuǎn)座基因可長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在采用piggyBac可逆性永生化系統(tǒng)建立人牙囊細(xì)胞系，并對獲得的永生化及去永生化牙囊細(xì)胞的增殖活性、多向分化潛能進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。
　　標(biāo)準(zhǔn)的間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化能力通常有限，如何誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)行定向分化是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，特定的生長因子則是誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)行特定方向分化的重要因素之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonem

3、orphogenetic protein，BMP）和過氧化物酶增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2，PPARγ2）分別是最常用的成骨和成脂誘導(dǎo)分化因子。而目前未見關(guān)于BMP9及PPARγ2對牙囊細(xì)胞定向分化能力影響的相關(guān)研究。因此本實(shí)驗(yàn)旨在分析BMP9對原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞的成骨和成軟骨能力的影響，以及PPARγ2對原代牙囊細(xì)胞、

4、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞成脂能力的影響。
　　方法：
　　1.采用有限稀釋法獲得單克隆原代牙囊細(xì)胞
　　2.采用piggyBac可逆性永生化系統(tǒng)獲得永生化及去永生化牙囊細(xì)胞
　　3.采用CCK8,細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法比較原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞增殖活性。
　　4.采用細(xì)胞免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)。
　　5.采用端粒

5、重復(fù)序列擴(kuò)增程序及石英晶體微天平兩種方法檢測原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞端粒酶活性。
　　6.采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、成骨基因及蛋白表達(dá)分析原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞體外成骨分化潛能。
　　7.采用阿利新藍(lán)染色、成軟骨基因及蛋白表達(dá)分析原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞體外成軟骨分化潛能。
　　8.采用脂紅染色、成脂基因及蛋白表達(dá)分析原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞

6、及去永生化牙囊細(xì)胞體外成脂分化潛能。
　　9.采用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色、相關(guān)基因及蛋白表達(dá)分析分析BMP9對原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞體外成骨、成軟骨分化能力影響。
　　10.采用脂紅染色、成脂基因及蛋白表達(dá)分析PPARγ2對原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞體外成脂分化能力影響。
　　11.裸鼠皮下異位植入牙囊細(xì)胞后進(jìn)行HE染色，MASSON染色分析原代牙囊細(xì)胞、永

7、生化牙囊細(xì)胞及去永生化牙囊細(xì)胞體內(nèi)分化能力。
　　結(jié)果：
　　1.永生化牙囊細(xì)胞增殖活性高于原代牙囊細(xì)胞，而去永生化牙囊細(xì)胞增殖增殖活性與原代牙囊細(xì)胞相似。
　　2.原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞均表達(dá)牙囊細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　3.原代牙囊細(xì)胞端粒酶活性隨傳代降低，永生化牙囊細(xì)胞端粒酶活性增強(qiáng)，且保持在較高水平，不隨傳代降低，去永生化牙囊細(xì)胞端粒酶活性與原代牙囊細(xì)胞類似。
　　4.原代牙囊細(xì)

8、胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化后堿性磷酸酶活性增強(qiáng)、茜素紅染色陽性、成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)升高。
　　5.原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化后阿利新藍(lán)染色陽性、成軟骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)升高。
　　6.代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化后脂紅染色陽性、成脂相關(guān)基因及蛋白表達(dá)升高。
　　7.BMP9感染后，原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞的堿性

9、磷酸酶活性、茜素紅染色、成骨成軟骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均較正常誘導(dǎo)組升高。
　　8.PPARγ2感染后，原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞的脂紅染色、成脂相關(guān)基因及蛋白表達(dá)均較正常誘導(dǎo)組升高。
　　9.原代牙囊細(xì)胞、永生化牙囊細(xì)胞、去永生化牙囊細(xì)胞可在裸鼠背部生成骨樣軟骨樣組織。
　　結(jié)論：
　　1.采用piggybac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)可以有效的建立永生化牙囊細(xì)胞系，所獲得的永生化牙囊細(xì)胞增殖活性快、多向分化能