凍存人源永生化肝細(xì)胞微囊用于生物人工肝治療的研究.pdf

1、背景:
　　每年因肝臟疾病死亡的人數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢。人工肝作為治療肝衰竭的有效手段成為近些年的研究熱點(diǎn)，其目標(biāo)為幫助病患等待適宜的供體器官或自體肝再生。我國在非生物型人工肝支持系統(tǒng)領(lǐng)域已經(jīng)取得較大進(jìn)步，但生物型人工肝系統(tǒng)的研究與國外發(fā)達(dá)國家相比尚有差距。
　　目的:
　　本課題組擬選擇功能最佳的人源性永生化肝細(xì)胞制作微囊，以大規(guī)模于液氮中凍存后，在新型生物人工肝支持系統(tǒng)中檢測肝衰竭病人血漿對肝細(xì)胞的毒性作用以及肝細(xì)胞

2、對肝衰竭病人血漿的清除效果，為生物型人工肝的臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.永生化人源肝細(xì)胞的功能評價(jià)。利用MTT、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光和Western blot及ELISA等檢測增殖及功能。
　　2.將反應(yīng)器流化培養(yǎng)的永生化肝細(xì)胞系微囊與靜態(tài)培養(yǎng)肝細(xì)胞系微囊、二維培養(yǎng)肝細(xì)胞作對比，比較細(xì)胞中與功能相關(guān)Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特異性核受體基因、CYP450蛋白表達(dá)的變化。檢測肝細(xì)胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成確定凍

3、存條件、凍存時(shí)間以及復(fù)蘇孵育條件并且評價(jià)微囊化肝細(xì)胞大規(guī)模凍存效果。
　　3.體外初步評價(jià)生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血漿，將復(fù)蘇并孵育后的肝細(xì)胞微囊加入到肝衰竭病人血漿中培養(yǎng)24h，觀察肝衰竭病人血漿對微囊內(nèi)肝細(xì)胞活性和功能的影響以及肝衰竭病人血漿內(nèi)重要物質(zhì)成分的變化。
　　結(jié)果:
　　1.HepLi3細(xì)胞增殖能力最好，可以進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，獲得高數(shù)量的細(xì)胞，而且其在功能上明顯優(yōu)于其他永生化肝細(xì)胞。
　　

4、2.微囊化和流化培養(yǎng)的肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持很好的活性;微囊化的培養(yǎng)方式可以促進(jìn)肝細(xì)胞特異基因及蛋白的表達(dá);此種培養(yǎng)方式可能是通過抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶活性來提高肝細(xì)胞特異性功能的。
　　3.確定微囊制作完成孵育2h后進(jìn)行凍存操作;凍存復(fù)蘇后孵育2h，其功能可恢復(fù)很好，且將體積擴(kuò)大到50毫升不會影響肝細(xì)胞的凍存后的功能。
　　4.肝衰竭病人血漿造成肝細(xì)胞活率下降12％，但不影響其作為種子細(xì)胞的應(yīng)用。而且微囊化肝細(xì)胞系可以改變肝衰

5、竭病人血漿中物質(zhì)成分，促進(jìn)其體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)室制作的HepLi3可作為生物人工肝的種子細(xì)胞有效發(fā)揮肝特異性功能。
　　2.確定了微囊的制作，肝細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的條件，并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促進(jìn)肝細(xì)胞功能的原因。
　　3.大規(guī)模凍存微囊化肝細(xì)胞后，細(xì)胞活性保持良好，可以為生物人工肝提供種子細(xì)胞庫。
　　4.利用肝衰竭病人血漿及生物反應(yīng)器證明凍存后的微