HH信號(hào)通路在肺部炎--癌轉(zhuǎn)化模型中的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　肺癌作為全球性的惡性腫瘤之一,病因非常復(fù)雜,吸煙、大氣污染、慢性肺部疾患等都與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明,COPD是誘發(fā)肺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,肺癌與COPD是吸煙相關(guān)的同源性疾病,甚至也是一種慢性炎癥相關(guān)性疾病。慢性炎癥主要通過激活多種蛋白及細(xì)胞因子組成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò),通過多種內(nèi)源性和/或外源性信號(hào)通路引起慢性炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化。因此EGFR信號(hào)通路作為重要的細(xì)胞代謝調(diào)控通路之一,多個(gè)節(jié)點(diǎn)或細(xì)胞因子已成為臨床上腫瘤靶向治

2、療的重要靶點(diǎn)。但其臨床有效率往往不到20％。提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及對(duì)藥物敏感性等方面可能存在多個(gè)信號(hào)通路的相互作用。其中Hedgehog(HH)信號(hào)通路的作用越來越受到人們的重視。
　　Hedgehog信號(hào)通路由配體HH,受體PTCH和SMO、轉(zhuǎn)錄因子GLI及SUFU等多種調(diào)控因子組成。已經(jīng)有人在多種惡性腫瘤組織中檢測到增高的Hedgehog信號(hào)通路蛋白。根據(jù)現(xiàn)有的研究進(jìn)展,在惡性腫瘤細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路活化的機(jī)制有幾

3、種可能,①Hedgehog配體的自分泌或旁分泌增多,可能與基因突變有關(guān),或與其他信號(hào)通路活性增強(qiáng)有關(guān);②PTCH突變;③SMO突變;④Sufu突變;⑤GLI基因突變等。此外,亦不除外因?yàn)槠渌嚓P(guān)信號(hào)通路的異常激活而刺激了本通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的過渡表達(dá)的可能。因此,到目前為止,在慢性炎癥導(dǎo)致的肺炎癌轉(zhuǎn)化過程中該通路的基因突變、蛋白表達(dá)情況及其相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　　本研究從摸清Hedgehog信號(hào)通路在臨床非小細(xì)胞肺癌(N

4、SCLC)患者病理組織中的實(shí)際表達(dá)情況入手,通過篩查NSCLC組織中Hedgehog信號(hào)通路基因突變的臨床研究、基于微流控芯片技術(shù)COPD發(fā)生炎-癌轉(zhuǎn)化模型的制備及HH信號(hào)通路的體外研究以及基于炎-癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞的成瘤裸鼠模型制備及Hedgehog信號(hào)通路功能的體內(nèi)研究三個(gè)部分,探討非小細(xì)胞肺癌組織中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)情況及調(diào)控措施,進(jìn)而為明確Hedgehog信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)效應(yīng)蛋白的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

5、
　　目的:
　　1.探討HH信號(hào)通路相關(guān)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中基因突變情況并與傳統(tǒng)EGFR信號(hào)通路相比較,以便了解HH信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌組織中的活性程度;
　　2.探討HH信號(hào)通路相關(guān)蛋白在COPD發(fā)生肺炎癌轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)情況;探討HH信號(hào)通路信號(hào)蛋白相關(guān)抑制因子對(duì)肺炎癌轉(zhuǎn)化過程的抑制作用;
　　3.利用已胸腺敲除的裸鼠,探討發(fā)生炎癌轉(zhuǎn)化后的支氣管上皮細(xì)胞的成瘤性,并檢驗(yàn)HH信號(hào)通路信號(hào)蛋白相關(guān)抑制因子對(duì)轉(zhuǎn)

6、化細(xì)胞成瘤性的抑制效果。
　　4.建立高通量、集成化、消耗少和速度快的微流控檢測芯片,以此為技術(shù)平臺(tái)在同一體系下對(duì)多種因子進(jìn)行聯(lián)合監(jiān)測,以提高檢測的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。
　　方法:
　　1.從非小細(xì)胞肺癌石蠟病理切片中提取DNA,提純后基因測序法檢測HH信號(hào)通路蛋白的基因突變情況。從分子水平了解非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中HH信號(hào)通路的活性并與EGFR信號(hào)通路的活性相比較。
　?、購谋驹翰±韼熘须S機(jī)選取非小細(xì)胞肺癌病理

7、組織蠟塊共40例,石蠟切片(取8張/例),手術(shù)刀刮取約30mg的組織樣本(盡量去除多余的石蠟)。石蠟基因組提取試劑盒提取DNA待檢。
　?、卺槍?duì)SHH、PTCH1、PTCH2、SMO、SUFU、EGFR、KRAS、PI3K等8個(gè)基因的外顯子設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物,第二代基因測序方法檢測PTCH1等Hedgehog/EGFR信號(hào)通路蛋白基因在非小細(xì)胞肺癌組織中的突變情況,并加以比較。
　　2.用PDMS(Polydimethyls

8、iloxane)為原料用標(biāo)準(zhǔn)軟光刻法制作含有濃度梯度發(fā)生器的芯片A和含有多通道多細(xì)胞培養(yǎng)池的芯片B。在含有濃度發(fā)生器的芯片A中按105細(xì)胞/室接種細(xì)胞,細(xì)胞貼壁后24h,將完全培養(yǎng)基和CSE溶液分別以7μl/min和5μl/min的速度泵入芯片,經(jīng)濃度梯度發(fā)生器產(chǎn)生6個(gè)不同的濃度分別刺激支氣管上皮細(xì)胞48h后,用Hoechst33342染色20分鐘,放在倒置熒光顯微鏡下(Olympus IX71,日本,放大200倍)觀察細(xì)胞凋亡情況,以

9、細(xì)胞生存率達(dá)80％以上時(shí)的最大濃度為最佳刺激濃度。使用該濃度長期刺激培養(yǎng)在微流控芯片B中的人支氣管上皮細(xì)胞,從而建立體外肺炎癌轉(zhuǎn)化模型。Westernblotting檢測Hedgehog信號(hào)通路蛋白在肺上皮細(xì)胞炎癌轉(zhuǎn)化不同時(shí)期的表達(dá)情況。
　　3.在用芯片B建立的體外肺炎癌轉(zhuǎn)化模型的基礎(chǔ)上,探討Hedgehog信號(hào)通路蛋白拮抗劑環(huán)靶明對(duì)Hedgehog信號(hào)通路蛋白表達(dá)及CSE刺激支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癌轉(zhuǎn)化過程的抑制作用。
　

10、　4.通過裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn),將刺激后發(fā)生轉(zhuǎn)化的支氣管上皮細(xì)胞接種到胸腺敲除裸鼠的左前腋下,觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞的成瘤性,同時(shí)檢測HH信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)相關(guān)抑制因子環(huán)靶明對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞成瘤性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.將突變臨界設(shè)定為5％水平,在對(duì)40例非小細(xì)胞肺癌組織中Hedgehog/EGFR信號(hào)通路蛋白的基因突變的篩查中,共檢測出包括單核苷突變、插入/缺失突變在內(nèi)的各類總突變位置138個(gè),數(shù)據(jù)庫中有注冊rsID的突變98個(gè),其中單核苷

11、酸突變86個(gè),缺失突變6個(gè),插入突變3個(gè)。在臨床突變數(shù)據(jù)庫clinvar有注釋的突變19個(gè)。主要集中在EGFR,KRAS,PTCH1和PTCH2四個(gè)基因。具有臨床注釋的19突變位點(diǎn)中,EGFR有6個(gè),KRAS有4個(gè),PTCH1為2個(gè),PTCH2有4個(gè),SUFU有3個(gè)。其中與致腫瘤有關(guān)或與靶向治療有關(guān)的突變主要集中在EGFR,KRAS和PTCH2上,趨勢上看以EGFR為主,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.通過濃度篩選,最終

12、選擇的CSE刺激濃度以12.25％。通過近8個(gè)月的刺激,支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照相比發(fā)生了根本變化,細(xì)胞核明顯增大,染色體增粗,細(xì)胞失去極性,以沒有顯著突變的SMO和GLI為Hedgehog信號(hào)通路活化代表的蛋白較正常細(xì)胞表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。而這一現(xiàn)象能夠被Hedgehog信號(hào)蛋白抑制劑環(huán)靶明顯著抑制(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)CSE長期刺激后的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以在裸鼠皮下生長成為腫瘤,但這種生長能被環(huán)靶明顯著抑制

13、(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Hedgehog/EGFR兩個(gè)信號(hào)通路突變活性趨勢上看以EGFR占優(yōu),但在有限樣本范圍內(nèi),二個(gè)通路之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),提示二者在肺癌的發(fā)生發(fā)展中都可以獨(dú)立決定腫瘤的生成與發(fā)展。
　　2.Hedgehog信號(hào)通路蛋白的基因突變主要集中在PTCH2和PTCH1上,其次是SUFU,而后者突變未發(fā)現(xiàn)臨床意義,而SHH、SMO、GLI幾乎沒有有效突變產(chǎn)生。因此,作為SMO抑

14、制劑的環(huán)靶明可能有效抑制Hedgehog信號(hào)通路的活性。
　　3.在CSE長期刺激的支氣管上皮細(xì)胞炎癌轉(zhuǎn)化過程中Hedgehog信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯增高,而這一現(xiàn)象能夠被Hedgehog信號(hào)蛋白抑制劑環(huán)靶明顯著抑制。同時(shí)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞可以在裸鼠皮下生長成為腫瘤,同樣這種生長過程也能被環(huán)靶明顯著抑制,這些證據(jù)表明Hedgehog信號(hào)通路在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。
　　4.含有濃度發(fā)生器的芯片以及多細(xì)胞培養(yǎng)池的芯片系統(tǒng)具