Notch信號(hào)通路在T1期腎透明細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 腎癌的致死率在泌尿系統(tǒng)腫瘤排名第二，約占全部腫瘤的2％。根據(jù)2009年AJCC腎癌的TNM分期，T1期腎癌是指局限于腎臟，最大徑≤7cm的腫瘤。大多數(shù)T1期腎癌都是局限性腫瘤，但是有少部分T1期腎癌會(huì)伴有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癥狀，即T1期轉(zhuǎn)移性腎癌。這部分病人往往病情兇險(xiǎn)，腫瘤進(jìn)展迅速，生存時(shí)間較短。目前臨床上對(duì)于T1期腎癌的手術(shù)治療方案尚存爭(zhēng)論，通常對(duì)于T1期局限性腎癌一般行保留腎單位手術(shù)，而對(duì)于T1期轉(zhuǎn)移性腎癌則

2、需行根治性腎切除術(shù)。然而除了影像學(xué)證據(jù)之外，臨床上還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種可以用于鑒別腎癌能否發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的分子靶標(biāo)，因此少數(shù)局限性腎癌患者行保留腎單位手術(shù)后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展，不得不接受二次手術(shù)治療，并且往往預(yù)后不佳。
　　 Notch信號(hào)通路是一個(gè)在不同物種進(jìn)化中相對(duì)高度保守的細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的通路。在脊椎動(dòng)物中，Notch受體家族包括四個(gè)成員(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)；Notch配體家族包括五個(gè)成員(Jag

3、ged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)。Notch信號(hào)通路的作用包括控制細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，它在胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)的決定中發(fā)揮了重要的作用。有研究報(bào)道，Notch信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展但根據(jù)組織的不同，Notch信號(hào)通路可能發(fā)揮促癌或者抑癌的生物學(xué)作用。
　　 到目前為止，Notch信號(hào)通路在腎癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制尚不明確。正是由于Notch信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性以及它在腎癌作用機(jī)制上的不

4、確定性，本文作者試圖通過(guò)深入的研究探尋Notch信號(hào)通路在腎癌，尤其是早期腎癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的具體作用，以期為臨床上預(yù)防和治療腎癌提供理論依據(jù)。方法：
　　 1、組織標(biāo)本：收集中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2009年至2010年51例腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本，包括25例轉(zhuǎn)移性腎癌、26例局限性腎癌及其配對(duì)的瘤旁非腫瘤腎皮質(zhì)組織。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)：正常人腎近曲小管上皮細(xì)胞株HKC以及腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-O和Caki-1。

5、　　 3、RNA提取和熒光定量PCR：使用總RNA提取試劑盒提取總RNA后再利用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。熒光定量PCR采用SYBER Green染料法比較Ct值。
　　 4、蛋白提取和Western-blot：RIPA裂解液提取組織及細(xì)胞蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗等步驟之后ECL發(fā)光檢測(cè)目的條帶。
　　 5、質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)照空白質(zhì)粒(pCMV6-Entry

6、)、Notch1表達(dá)質(zhì)粒(pCMV6-Notch1，)和Jaggedl表達(dá)質(zhì)粒(pCMV6-Jagged1)使用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。
　　 6、MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后加入MTS試劑，然后用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下讀取吸光值檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。
　　 7、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞鋪板于Transwell小室中，檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。
　　 8、流式細(xì)胞儀法檢測(cè)細(xì)胞周期：轉(zhuǎn)染后將細(xì)

7、胞收集、固定和染色后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、在HKC和786-O細(xì)胞株上，Notch1和Jagged1在mRNA和蛋白質(zhì)水平都有表達(dá)；Notch1和Jagged1在腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)水平高于正常腎皮質(zhì)細(xì)胞株。
　　 2、腫瘤組織Notch1和Jagged1在mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著性高于瘤旁正常腎組織。Notch1在轉(zhuǎn)移性腎癌中的表達(dá)水平高于局限性腎癌組織；Jagged1

8、則相反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、在不同分期的腫瘤組織中，Notch1僅在T1期轉(zhuǎn)移性腎癌組織的表達(dá)顯著高于局限性腎癌。Jagged1的表達(dá)水平在各組分期中都沒(méi)有顯著性差異。
　　 4、T1期轉(zhuǎn)移性腎癌的平均直徑顯著大于T1期局限性腎癌的平均直徑。Notch1的表達(dá)水平和腫瘤直徑呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Jagged1的表達(dá)與腫瘤直徑?jīng)]有相關(guān)性。
　　 5、Notch1和Jagged1可以顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞

9、株786-O和Caki-1的增殖能力。但僅有Notch1能夠促進(jìn)正常腎臟上皮細(xì)胞株HKC的增殖，Jagged1則不行。
　　 6、Notch1和Jagged1可以顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞株786-O和Caki-1的遷移能力。在兩株細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)Notch1和Jagged1之后，轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因MMP-9的mRNA表達(dá)水平顯著增加。
　　 7、過(guò)表達(dá)Notch1和Jagged1并不影響所有細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化并且細(xì)胞周期相關(guān)基因P2