Nrf2和FAT4在食管癌中的表達(dá)和臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　食管癌在我國(guó)高發(fā)，且病死率高，由于早期診斷方法有限，預(yù)后不良，5年生存率10％-25％。食管早癌主要采用內(nèi)鏡治療，術(shù)后五年生存率超過95％。食管癌的發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移是由多因素共同參與，通過各種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，它們之間相互協(xié)調(diào)制約。因此尋找參與食管癌發(fā)生發(fā)展的重要分子并探討其在食管癌發(fā)生中的分子機(jī)制，對(duì)提高食管癌的早期診斷，尋找新的治療靶點(diǎn)，提高病人生存率有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是維持細(xì)胞的氧化還原平衡必不可少

2、的，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在氧化和外源性應(yīng)激條件下通過調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)性起著保護(hù)性作用，并抑制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，同時(shí)Nrf2活化有助于腫瘤的進(jìn)展和放化療抵抗。FAT蛋白是鈣黏超家族中分子量最大的一類，它們參與調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生、控制生長(zhǎng)、平面細(xì)胞極性，其中FAT1和FAT4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前FAT4與食管淺表癌、食管癌的關(guān)系少有報(bào)告，Nrf2與食管淺表癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系還沒有報(bào)告。
　　目的：
　　本

3、研究探討Nrf2與鈣黏蛋白FAT4在食管淺表癌及食管癌組織及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中mRNA表達(dá)，并分析與臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。方法
　　1.病例收集
　　2016年5月至2016年11月間在山東大學(xué)第二醫(yī)院接受內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)和手術(shù)治療食管鱗癌及上皮內(nèi)瘤變患者的組織標(biāo)本及外周血，共43例，以15例正常人的外周血為對(duì)照。排除標(biāo)準(zhǔn):1）術(shù)前接受放化療的患者，2）患者同時(shí)有兩種或兩種以上的腫瘤。按國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)第7版

4、(2009)進(jìn)行分期，Ⅰ期11例，Ⅱ期8例，Ⅲ期/Ⅳ期12例，其中Ⅳ期患者為術(shù)中發(fā)現(xiàn)無法進(jìn)行根治性切除行姑息性治療。T分期中，T1/T2者14例，T3/T4者17例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者17例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例。頸胸上段2例，胸中段18例，胸下段23例。長(zhǎng)度小于5cm病變32例，長(zhǎng)度大于5cm病變11例。
　　2.Nrf2和FAT4的免疫組化
　　石蠟切片脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)15分鐘，PBS洗滌三次，3％H2O2阻斷內(nèi)源性

5、過氧化物酶，山羊血清封閉30min，滴加一抗4℃孵育過夜。切片洗凈后，二抗孵育（30分鐘），并用DAB顯色。切片用蘇木精復(fù)染，然后洗滌和脫水。以陽(yáng)性反應(yīng)為陽(yáng)性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照。
　　3.Nrf2和FAT4 mRNA的熒光定量PCR
　　使用人外周血淋巴細(xì)胞分離液從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取單個(gè)核細(xì)胞，Trizol裂解細(xì)胞，mRNA由氯仿-異丙醇-乙醇沉淀法提取，測(cè)定總濃度。取1μl進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成，PCR擴(kuò)增:R

6、eal-time qPCR采用25μl的反應(yīng)體系，具體操作參照SYBR(@)Premix Ex Taq TM（RR420A）的使用說明。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　計(jì)數(shù)資料的組間比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.Nrf2蛋白在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況
　　Nrf2在細(xì)胞核或細(xì)胞

7、質(zhì)中呈淡黃色或棕褐色顆粒。Nrf2蛋白在病變組織及正常食管組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為62.79％(27/43)、13.95％(6/43)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=21.684，P＜0.05)，食管淺表癌和進(jìn)展期食管癌的Nrf2表達(dá)的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=18.496，P＜0.001），正常食管鱗狀上皮組和鱗狀細(xì)胞癌組（P＜0.001）、上皮內(nèi)瘤變組和鱗狀細(xì)胞癌組(P＜0.001) Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常食管

8、鱗狀上皮組和上皮內(nèi)瘤變組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。臨床病理因素分析:Nrf2蛋白表達(dá)與病變長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度、T分期密切相關(guān)（P＜0.05），但與病變部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無顯著相關(guān)（P＞0.05）。
　　2.FAT4蛋白在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)顯示:免疫組織化學(xué)顯示:FAT4陽(yáng)性表現(xiàn)主要為胞漿或胞核染成黃褐色或棕黃色。FAT4蛋白在病變組織及正常食管組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為32.56％(

9、14/43)、65.12％(28/43)，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.118，P=0.005＜0.05)。食管淺表癌和進(jìn)展期食管癌的FAT4陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.918，P=0.003＜0.05)。正常食管鱗狀上皮組和上皮內(nèi)瘤變組（P=0.188＞0.05），上皮內(nèi)瘤變和鱗狀細(xì)胞癌(P=0.482＞0.05)的FAT4表達(dá)陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常食管鱗狀上皮組和鱗狀細(xì)胞癌組(P=0.004＜0.05)F

10、AT4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。臨床病理因素分析顯示:FAT4蛋白表達(dá)與浸潤(rùn)深度、T分期、TNM分期相關(guān)（P＜0.05），但與病變部位、病變長(zhǎng)度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)(P＞0.05）。
　　3.Nrf2 mRNA和FAT4 mRNA在PBMC中的表達(dá)
　　qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在43例患者和15例對(duì)照中，Nrf2 mRNA和FAT4mRNA在單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(分別為P=0.068＞0.05和P=0.263