NK13菌(Bacillus megaterium)中拆分酮基布洛芬同工酶的研究.pdf

1、酮基布洛芬屬于2-芳基丙酸類藥物，是一種重要的非甾體抗炎藥，療效優(yōu)于同類布洛芬。臨床上廣泛使用的酮基布洛芬是由化學(xué)方法合成的外消旋體，包含(S)-型和(R)-型兩種對映體。研究表明，(S)-酮基布洛芬起主要抗炎鎮(zhèn)痛作用，因此患者使用的該藥只有一半具有藥效。利用微生物中酯酶/脂肪酶立體選擇性拆分獲得具有光學(xué)活性的單一對映體具有重要的應(yīng)用價值。過去的研究發(fā)現(xiàn)，從自然界篩選出的手性底物高轉(zhuǎn)化活性的野生菌，存在產(chǎn)物光學(xué)純度不高的問題。
　

2、　 本文以實驗室篩選出的轉(zhuǎn)化率高且具有一定不對稱轉(zhuǎn)化外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株Bacillus megaterium NK13和攜帶來自該菌株的三種酯酶同工酶基因的工程菌為材料(本文將工程菌命名為T、X、L，其質(zhì)粒所含外源基因GenBank登錄號分別為DQ196347、EU381317、GU143552)，對同工酶轉(zhuǎn)化酮基布洛芬進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。首先，鑒定了已構(gòu)建的工程菌T低表達(dá)的原因不是目的基因的丟失造成的，通過重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)

3、化，使工程菌獲得了高表達(dá)。
　　 然后，以乙酸對硝基苯酯為底物，測定溫度對3種同工酶活性的影響。結(jié)果顯示三種酶的催化最適溫度不同，酯酶T、L、X的最適溫度分別是37℃、24℃和37℃。
　　 建立了重復(fù)性好、便于操作的PBS轉(zhuǎn)化體系，用以探討三種工程菌的不同組合在此體系中轉(zhuǎn)化外消旋酮基布洛芬氯乙酯，通過薄層層析和高壓液相檢測轉(zhuǎn)化效果。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種工程菌分別轉(zhuǎn)化時，雖然工程菌X轉(zhuǎn)化活力較另兩種工程菌低，但

4、是產(chǎn)物(S)-酮基布洛芬過量可達(dá)88.72％，而工程菌T和L的產(chǎn)物過量值分別是(S)-酮基布洛芬過量62.26%和(R)-酮基布洛芬過量67.16%。三種工程菌兩兩組合轉(zhuǎn)化時，仍發(fā)現(xiàn)脂肪酶X較低的轉(zhuǎn)化活性。而酯酶T和L活性高，組合轉(zhuǎn)化時共同作用造成(S)-酮基布洛芬過量e.e.值為22.20%。三種工程菌共轉(zhuǎn)化的結(jié)果與出發(fā)菌NK13有極為相似的趨勢，工程菌共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率從36.7%升高為46.4%時，產(chǎn)物從(R)對映體過量7.3%變?yōu)?

5、S)對映體過量約6.3%;NK13菌轉(zhuǎn)化率從39.1%到48.3%，對映體過量e.e.值從(R)-型11.22%到(S)-型2.84%。在本實驗條件下，三種工程菌的共轉(zhuǎn)化能模擬出NK13菌株的實際轉(zhuǎn)化情況。
　　 進(jìn)一步用SDS-PAGE法對三種同工酶進(jìn)行純化，得到了電泳純酶；三種純酶的共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(S)-酮基布洛芬e.e.值為6.48%。該結(jié)果與菌體轉(zhuǎn)化結(jié)果相似，進(jìn)而說明，來自NK13菌株中的三種酯酶同工酶，其水解外消旋酮基布洛