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1、利用生物系統(tǒng)獲得光學(xué)純化合物已經(jīng)逐漸成為化學(xué)合成方法之外的另一選擇。2-芳基丙酸類藥物是一類重要的非甾體抗炎藥。利用微生物中脂肪酶立體選擇性的拆分,獲得具有光學(xué)活性的2-芳基丙酸類藥物(如:酮基布洛芬和奈普生)的單一對(duì)映體己成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 本文以本實(shí)驗(yàn)室篩選出的具有一定不對(duì)稱轉(zhuǎn)化外消旋酮基布絡(luò)芬氯乙酯生成(S)-酮基布洛芬能力的菌株NK13#及從該菌2~6kbp大小DNA片斷的基因組文庫(kù)中篩選得到的含酯酶基因的轉(zhuǎn)化子
2、為材料,通過(guò)亞克隆構(gòu)建了一株表達(dá)重組菌,采用水解三丁酸甘油酯的透明圈法篩選到了目的克隆。 經(jīng)PCR擴(kuò)增、克隆和核苷酸測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果與Genbank中已知基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),證明亞克隆得到的酯酶屬首次發(fā)現(xiàn),提交GENBANK,注冊(cè)號(hào)為:DQ196347。提取的克隆質(zhì)粒中包含完整的酯酶可讀框長(zhǎng)933bp,編碼310個(gè)氨基酸,分析表明該酯酶為疏水的酸性蛋白。 利用PhenylSepharoseCL-4B疏水柱層析柱取代
3、了昂貴的Ni柱進(jìn)行蛋白分離純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)證明疏水層析純化到了單一的34KDa酯酶蛋白。 實(shí)驗(yàn)中以不同濃度的IPTG和乳糖作為誘導(dǎo)劑,進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)了低濃度的外消旋乳糖同樣可以誘導(dǎo)表達(dá)菌株大量產(chǎn)酶;同時(shí),質(zhì)粒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),證實(shí)了連續(xù)遺傳100代后,表達(dá)菌株中的pET-NKestl質(zhì)粒穩(wěn)定性仍高達(dá)90%以上,這些對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)都有著非常重要的實(shí)際意義。 薄層層析與HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示,表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化效率明顯
4、提高,由亞克隆前菌株12小時(shí)可以轉(zhuǎn)化62.6%的酮基布洛芬氯乙酯到表達(dá)菌45分鐘就能轉(zhuǎn)化47.4%,而得到的(S)-酮基布洛芬過(guò)量(e.e.%)達(dá)到55.46%(S-酮基布洛芬為77.73%,R-酮基布洛芬為22.27%),是原始野生型NK13#菌株轉(zhuǎn)化光學(xué)純度e.e.%(5.84%)的9.5倍,充分說(shuō)明了該酯酶具有優(yōu)先拆分得到S-酮基布洛芬的特性。如果能對(duì)表達(dá)重組菌生長(zhǎng)條件及轉(zhuǎn)化底物時(shí)的條件(pH、溫度、轉(zhuǎn)化率等)進(jìn)一步優(yōu)化,將有望得
5、到更高光學(xué)純度的S-酮基布洛芬。 借助不同的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和生物學(xué)軟件分析了該酯酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu),探討了酯酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能,初步分析說(shuō)明了該酯酶N’端的203位點(diǎn)的氨基酸殘基,可能是影響酶蛋白拆分手性藥物能力的關(guān)鍵位點(diǎn)。如果能進(jìn)一步通過(guò)人工合成特定堿基序列、表達(dá)出具有專一性拆分得到S-酮基布洛芬能力的酯酶,從而通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)影響酯酶光學(xué)純拆分能力的活性位點(diǎn),必將對(duì)研究包括酮基布洛芬在內(nèi)的許多手性藥物的生物酶法拆分起到極其重
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