ERβ對(duì)小鼠海馬actin細(xì)胞骨架聚合與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究報(bào)道隨著年齡的逐漸增長(zhǎng)，老化所引起的雌激素(estrogen，E2)水平降低在癡呆癥如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)的學(xué)習(xí)記憶方面扮演著重要的角色。目前，AD的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，現(xiàn)有的治療方案療效并不理想。因此，研究探索AD的發(fā)病機(jī)理和治療方法對(duì)于預(yù)防和治療AD，促進(jìn)醫(yī)療護(hù)理和家庭照護(hù)都具有深遠(yuǎn)的影響。
　　E2不僅可以影響女性的生理發(fā)育，還在改善老年的記憶力衰退方面也具有積極的作用，在調(diào)

2、控海馬突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)過程中需要借助雌激素受體(estrogen receptor,ER)的參與來產(chǎn)生作用。E2的受體分為兩大類:一類是膜受體GPR30，位于細(xì)胞內(nèi)的膜性成分包括細(xì)胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，通過第二信使途徑介導(dǎo)E2對(duì)某些生理功能的調(diào)節(jié);另一類是經(jīng)典的核受體，包括雌激素α受體(estrogen receptorα，ERα)和雌激素β受體（estrogen receptorβ，ERβ），它們主要在細(xì)胞核內(nèi)通過與D

3、NA結(jié)合從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。類固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1，SRC-1)作為是促進(jìn)核受體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)所必需的輔助因子之一，高表達(dá)于海馬、大腦皮層等腦區(qū)，其表達(dá)受產(chǎn)后發(fā)育和性腺切除的影響。有研究表明在給予卵巢切除手術(shù)和核受體抑制劑處理后海馬突觸蛋白表達(dá)和突觸及樹突棘密度明顯下降，雌激素替代治療及其核受體激動(dòng)劑可以增加突觸蛋白的表達(dá)和樹突棘的密度，但ERβ在當(dāng)中的作用機(jī)制目前

4、尚不明確。
　　ERβ克隆于1996年，過去20年的研究發(fā)現(xiàn)ERβ在多種動(dòng)物的體內(nèi)均有較為廣泛的表達(dá)，并且參與了E2對(duì)多種腦功能作用的調(diào)節(jié)，且在不同的分區(qū)其表達(dá)分布和功能作用也不盡相同。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，大腦皮層、海馬等區(qū)域有大量ERβ的表達(dá)，提示ERβ可能扮演著介導(dǎo)E2調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的功能性受體的角色。在生殖系統(tǒng)，睪丸、卵巢等組織器官內(nèi)可檢測(cè)到ERβ的存在，它可能參與E2調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等過程。另外，在心血管、消化道等系統(tǒng)

5、內(nèi)也可檢測(cè)到ERβmRNA，并且也具有十分重要生理意義。腦內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，利用ERβ特異性拮抗劑以及基因敲除等方法抑制ERβ后，發(fā)現(xiàn)海馬突觸蛋白表達(dá)顯著下降，樹突棘密度降低，出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙。通過ERβ激動(dòng)劑活化ERβ可改善突觸可塑性和提高空間學(xué)習(xí)記憶，提示ERβ對(duì)學(xué)習(xí)記憶有著重要的調(diào)控作，但是其具體機(jī)制尚不清楚。
　　肌動(dòng)蛋白(actin)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分，actin聚合與解聚的動(dòng)態(tài)變化是突觸可塑性的基礎(chǔ)，也是學(xué)習(xí)記憶

6、的基礎(chǔ)。球狀肌動(dòng)蛋白(即G-actin)在Profilin-1等分子的誘導(dǎo)下聚合成為螺旋狀的肌動(dòng)蛋白(F-actin)。因此，F(xiàn)-actin/G-actin比例的變化常作為衡量的肌動(dòng)蛋白聚合程度的指標(biāo)。研究還發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2（mammalian target of rapamycincomplex2，mTORC2）對(duì)actin細(xì)胞骨架的聚合有著重要的調(diào)節(jié)作用，敲除mTORC2的核心成分Rictor導(dǎo)致actin聚合程度

7、與樹突棘密度下降，并導(dǎo)致嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙，而直接激活Rictor的效應(yīng)分子p-AKT(AKT ser473)可逆轉(zhuǎn)上述學(xué)習(xí)記憶障礙，證明mTORC2在調(diào)節(jié)actin細(xì)胞骨架聚合與學(xué)習(xí)記憶中的重要作用。既往研究報(bào)道ERβ可調(diào)節(jié)樹突棘密度和學(xué)習(xí)記憶行為，但是ERβ是否調(diào)控actin細(xì)胞骨架聚合尚不清楚。
　　目的:
　　探討ERβ在調(diào)控海馬神經(jīng)元actin細(xì)胞骨架多聚化以及學(xué)習(xí)記憶中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　

8、　1、為了解ERβ在生后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)海馬的表達(dá)情況，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)、免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了ERβ在生后不同發(fā)育時(shí)期(P0，P7，P14，P28，P56)雌、雄小鼠海馬的表達(dá)變化。
　　2、為了探討激活ERβ對(duì)海馬actin細(xì)胞骨架聚合以及學(xué)習(xí)記憶的影響，將成年小鼠進(jìn)行卵巢切除(ovariectomy，OVX)，1w后在頸背部皮下注射不同

9、劑量ERβ激動(dòng)劑DPN進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，分為假手術(shù)對(duì)照(Control)、卵巢切除(OVX)、OVX+1.25mg/kg DPN、OVX+2.5mg/kg DPN、OVX+5.0mg/kg DPN共5組，通過檢測(cè)上述處理?xiàng)l件下海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT以及actin細(xì)胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)的表達(dá)變化確定DPN處理的最佳劑量。然后，在最佳劑量(5.0mg/kg DPN)

10、的處理?xiàng)l件下，檢測(cè)了DPN對(duì)OVX后上述分子表達(dá)、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)的變化、海馬樹突棘密度以及學(xué)習(xí)記憶行為變化的調(diào)控。
　　3、取成年動(dòng)情間期雌性小鼠，腹腔注射相同劑量（100ug/kg）ERβ抑制劑PHTPP，分為溶劑對(duì)照(Control)及PHTPP注射1、3、5、7d共5組，通過檢測(cè)海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、p-cofilin/cofilin、Profilin-

11、1的表達(dá)變化來確定PHTPP處理的最佳時(shí)間點(diǎn)。然后，在此最佳時(shí)間點(diǎn)(7d)條件下，運(yùn)用Morris水迷宮方法觀察小鼠空間記憶行為的變化情況，用WB、IHC以及高爾基鍍銀染色等方法來檢測(cè)抑制ERβ活性后海馬SRC-1、Rictor、p-AKT和actin細(xì)胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)的表達(dá)變化、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)、海馬區(qū)的樹突棘密度的變化，以此來探索ERβ

12、活性改變與學(xué)習(xí)記憶之間的相互聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　1、ERβ在雌、雄小鼠P0、P7、P14、P28、P56海馬中都有表達(dá)。在P0時(shí)表達(dá)高，在P7和P14時(shí)表達(dá)下降，在P28和P56時(shí)表達(dá)增加。雄性小鼠在P28時(shí)達(dá)到P0時(shí)水平，但雌性小鼠在P28時(shí)就已高于P0時(shí)的表達(dá)。
　　2、OVX后海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細(xì)胞骨架聚合蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-

13、1)表達(dá)均下降，1.25mg/kg DPN時(shí)僅Profilin-1的表達(dá)增加而其余分子表達(dá)無明顯變化，在2.5-5.0mg/kg DPN時(shí)上述所有分子表達(dá)較OVX組上升，因此，選取5.0mg/kg為DPN的最佳劑量。Morris水迷宮發(fā)現(xiàn)OVX后雌性小鼠的學(xué)習(xí)記憶下降，高爾基鍍銀染色結(jié)果顯示OVX組海馬樹突棘密度減少，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)（immunohistochemistry,IHC）和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot，WB)顯示

14、OVX組SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細(xì)胞骨架聚合調(diào)控蛋白、actin聚合狀態(tài)(F-actin/G-actin比值)的表達(dá)下降，5.0mg/kg DPN處理可以逆轉(zhuǎn)OVX所致的上述變化。
　　3、海馬SRC-1、Rictor、p-AKT、actin細(xì)胞骨架聚合調(diào)控蛋白(p-cofilin/cofilin、Profilin-1)在給予PHTPP注射5d時(shí)表達(dá)開始下降，除Profilin-1外其余各分子表達(dá)

15、在7d時(shí)顯著下降，因此，確定7d為PHTPP處理的最佳時(shí)間。在此條件下，Morris水迷宮發(fā)現(xiàn)PHTPP可致雌性小鼠的學(xué)習(xí)記憶下降，高爾基鍍銀染色結(jié)果顯示海馬樹突棘密度減少，IHC和Western blot顯示PHTPP下調(diào)海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細(xì)胞骨架聚合相關(guān)蛋白、actin聚合程度（F-actin/G-actin比值）的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、ERβ在雌、雄小鼠生后海馬內(nèi)(P0

16、～P56)均有表達(dá)，且在出生時(shí)和成年時(shí)維持在較高水平，呈現(xiàn)出“U-型”變化的趨勢(shì)。
　　2、激活ERβ可逆轉(zhuǎn)OVX所致的海馬SRC-1、Rictor及下游靶分子p-AKT、actin細(xì)胞骨架聚合蛋白表達(dá)及海馬樹突棘密度的下降、actin聚合狀態(tài)的解聚和學(xué)習(xí)記憶行為障礙，提示活化ERβ可通過促進(jìn)actin細(xì)胞骨架的聚合進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶行為。
　　3、抑制ERβ可下調(diào)海馬SRC-1、Rictor及下游效應(yīng)分子p-AKT、acti

17、n細(xì)胞骨架聚合蛋白表達(dá)以及海馬樹突棘密度，促進(jìn)actin聚合狀態(tài)的解聚，動(dòng)物出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶行為障礙，提示抑制ERβ活性通過促進(jìn)actin細(xì)胞骨架的解聚進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶行為障礙。
　　綜上所述，在本研究中，采用了卵巢切除、Morris水迷宮、IHC、Western blot以及高爾基鍍銀染色等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，研究了調(diào)節(jié)ERβ活性變化對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為以及SRC-1、mTORC2通路蛋白和actin細(xì)胞骨架聚合的影響，結(jié)合文獻(xiàn)我