銀杏不同樹齡維管形成層活動(dòng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、古樹的壽命可長(zhǎng)達(dá)上百年甚至上千年，是不可再生的重要自然資源，是活的化石，在科學(xué)研究中具有極其重要的地位。目前古樹壽命分子調(diào)控機(jī)理的研究極少，這是由于古樹的分布區(qū)域差異大、受環(huán)境的破壞以及實(shí)驗(yàn)材料不容易獲得等原因。樹木的維管形成層(vascular cambium)具有不斷分裂分化的能力，又被稱為“形成層干細(xì)胞”，在古樹的生長(zhǎng)過程中，通過不斷的分裂分化維持樹木的繼續(xù)生長(zhǎng)與增粗，不僅能準(zhǔn)確反應(yīng)古樹的樹齡，且因其位置及材質(zhì)的穩(wěn)定性使得取材方便

2、。銀杏（Ginkgo bilobaL.）是現(xiàn)存最古老的裸子植物之一，在中國分布許多百年以上甚至千年的古銀杏。本研究利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)雌株銀杏不同樹齡維管形成層進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，并結(jié)合細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)銀杏主干維管形成層進(jìn)行研究，其主要研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)不同樹齡銀杏樹生長(zhǎng)情況、葉片、結(jié)實(shí)以及種子萌發(fā)情況進(jìn)行了評(píng)估和測(cè)定工作。發(fā)現(xiàn)樹齡分別為20年，200年和600年左右的銀杏樹上沒有明顯的機(jī)械

3、損傷，病蟲害等現(xiàn)象。三組樹齡銀杏樹結(jié)實(shí)正常，并且種子萌發(fā)率正常。
　　2.利用半薄切片技術(shù)，對(duì)包含有韌皮部、形成層和木質(zhì)部的包埋樣品進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)樹齡為20年的銀杏形成層細(xì)胞層數(shù)有7至9層，而古樹組200年和600年的銀杏維管形成層細(xì)胞層數(shù)明顯減少。
　　3.通過Illumina HiSeqTM2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)三組不同樹齡銀杏形成層進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得三組樣品Clean read分別為54，580，856(52，07

4、0，908)，55，414，956(53，212，132)，54，600，518(52，615，596)條，Q20％在98％之上。之后，通過Trinity軟件組裝，共獲得97，303條unigenes，平均長(zhǎng)度為1500bp，N50為2，476bp。
　　4.將97，303條序列通過BLASTx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有63，912條unigenes被注釋在6大數(shù)據(jù)庫。其中，在NR數(shù)據(jù)庫中注釋到62，266條，占到總unigenes數(shù)量的63

5、.99％。此外，COG功能注釋發(fā)現(xiàn)有25類群，其中轉(zhuǎn)錄本、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分裂功能類群較多。
　　5.經(jīng)差異基因表達(dá)篩選，我們發(fā)現(xiàn)20年與200年間差異基因有2，572條，20年與600年間差異基因有1，312條，以及200年與600年間差異基因有891條。通過與20年相比，古樹組差異基因都明顯GO富集在細(xì)胞成分的胞外區(qū)，分子功能下的氧化還原酶活性，以及生物學(xué)過程中的次生細(xì)胞壁生物合成和木質(zhì)素代謝過程。此外，通過K

6、EGG富集發(fā)現(xiàn)，20年與200年，20年與600年以及200年與600年之間的差異基因KO富集的前兩個(gè)通路都是代謝通路和次生代謝合成。
　　6.在形成層區(qū)域其自身細(xì)胞分裂能力對(duì)于維管組織的生長(zhǎng)是非常重要。因而，我們對(duì)被注釋為細(xì)胞分裂以及擴(kuò)增相關(guān)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有21個(gè)候選基因，在20年中高表達(dá)，而在古樹200年和600年中低表達(dá)。此外，我們也發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁生物合成相關(guān)的基因在20年中高表達(dá)，而在古樹中表達(dá)量下降。
　　7.我

7、們對(duì)被注釋在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中基因分析，發(fā)現(xiàn)有大量基因是響應(yīng)生長(zhǎng)素，赤霉素，細(xì)胞分裂素，脫落酸，乙烯和油菜素內(nèi)酉旨，并且它們?cè)诓煌瑯潺g間有著不同的表達(dá)模式。其中被注釋與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相關(guān)的基因高表在20年樹齡中，而低表達(dá)在古樹組中。而脫落酸受體PYR/PYL基因以及乙烯生物合成相關(guān)基因在古樹組高表達(dá)而低表達(dá)在20年銀杏形成層中。
　　8.在銀杏維管形成層中預(yù)測(cè)到2，814個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分屬于59個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。其中MYB(12.

8、40％)，AP2-EREBP(8.02％)和MYB-related(7.74％)轉(zhuǎn)錄因子家族成員最多。此外，通過RPKM＞0.3值篩選轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族基因分布在20年、200年和600年都在30％左右。此外，我們進(jìn)一步研究了差異轉(zhuǎn)錄因子在三組不同樹齡銀杏維管形成層中表達(dá)情況，如注釋為GAMYB，MADS，bHLH，TCP和zinc transporter2-1ike等轉(zhuǎn)錄因子。其中與20年對(duì)比，總體上古樹組200年和600

9、年更多是呈下降趨勢(shì)。
　　9.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證與細(xì)胞分裂分化、細(xì)胞壁生物合成以及植物激素等差異基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNA-Seq和qRT-PCR表達(dá)趨勢(shì)上一致并且其差異倍數(shù)一致性也較好，表明高通量測(cè)序結(jié)果是可靠的。這些結(jié)果進(jìn)一步闡明與細(xì)胞分裂分化，細(xì)胞壁生物合成以及植物激素相關(guān)基因在不同樹齡的銀杏維管形成層中的表達(dá)量是不同的。
　　綜上所述，本研究通過RNA-Seq結(jié)合細(xì)胞學(xué)，分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)研究銀杏不同