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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:寒證為八綱之一,婦科寒證是臨床較為多見的病證之一。婦科寒證有實(shí)寒證、虛寒證之分,兩者的病機(jī)、臨床表現(xiàn)和治法用藥各不相同。臨床鑒別實(shí)寒證、虛寒證主要以患者主訴為依據(jù),但常有主觀因素。對(duì)于兩證客觀指標(biāo)的變化,學(xué)者們應(yīng)用病理學(xué)、分子生物學(xué)等方法進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)實(shí)寒證、虛寒證機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫、細(xì)胞因子及體內(nèi)微量元素含量都較正常有不同程度的變化,但尚缺乏兩證的對(duì)照研究,且未發(fā)現(xiàn)可以區(qū)分兩者的特異性指標(biāo)。因此,實(shí)寒證、虛寒證的生物學(xué)本
2、質(zhì)之間究竟有無差異及其差異點(diǎn)至今仍未明確?!白C”是中醫(yī)辨證論治的根本,也是中醫(yī)精華所在和發(fā)展中醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵?!白C”本質(zhì)一直是中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究的核心內(nèi)容,闡明中醫(yī)“證”本質(zhì)是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)現(xiàn)代化必須解決的關(guān)鍵問題。
本課題從臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層次,以代謝組學(xué)為研究手段,比較實(shí)寒證、虛寒證痛經(jīng)患者尿液代謝產(chǎn)物的異同,尋找兩證的差異性物質(zhì);創(chuàng)建婦科虛寒證大鼠模型;以婦科實(shí)寒證、虛寒證模型大鼠為研究對(duì)象,從機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)及能量代謝
3、角度,進(jìn)一步闡釋臨床代謝組學(xué)結(jié)果,探究婦科實(shí)寒證、虛寒證發(fā)生過程中機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的變化規(guī)律,比較不同證在發(fā)生過程中機(jī)體調(diào)控機(jī)制的異同,明確兩者的生物學(xué)本質(zhì)特點(diǎn),促進(jìn)中醫(yī)診斷學(xué)和中醫(yī)婦科學(xué)的發(fā)展。
方法:
1以實(shí)寒證、虛寒證痛經(jīng)患者及正常對(duì)照組為研究對(duì)象,選擇N-甲基-N-三甲基-硅基三氟乙酰胺(MSTFA)作為衍生化試劑對(duì)各組月經(jīng)周期第2d(MC2)尿液代謝產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOFMS)檢測(cè),得出各
4、組總離子流色譜圖(TIC),結(jié)合非監(jiān)督的主成分分析(PCA)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析,尋找實(shí)寒組、虛寒組及正常組的差異代謝產(chǎn)物。放射免疫分析法(RIA)檢測(cè)上述三組MC2血清生殖內(nèi)分泌激素,包括卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)及睪酮(T);化學(xué)法檢測(cè)三組MC2、MC7空腹血糖(FPG)、血脂及尿糖。
2模擬婦科虛寒證發(fā)生的病因,依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)理論,采用延長(zhǎng)冰箱冷凍加冰水浸泡時(shí)間方法創(chuàng)建婦科虛
5、寒證大鼠模型。將SD雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和治療組,每組各10只。模型組、治療組置于0℃~1℃冰水中并放入4℃冰箱中,2次/d,20min/次,共30d。正常組常規(guī)飼養(yǎng),治療組造模同時(shí)灌胃金匱溫經(jīng)湯,其余兩組灌胃等體積蒸餾水。造模結(jié)束后,擇動(dòng)情間期處死大鼠,觀察各組大鼠一般情況、肛溫、體重及子宮、卵巢形態(tài);檢測(cè)血清FSH、LH、E2、P、T,血漿皮質(zhì)酮(CORT),血清白介素2(IL-2),血漿cAMP、cGMP、cA
6、MP/cGMP及胸腺、脾臟、子宮、卵巢指數(shù)。
3以婦科實(shí)寒證、虛寒證模型大鼠為研究對(duì)象,比較兩證形成過程中神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)調(diào)控的異同。采用冰水浸泡方法創(chuàng)建實(shí)寒證大鼠模型;采用延長(zhǎng)冰箱冷凍加冰水浸泡時(shí)間方法創(chuàng)建虛寒證大鼠模型;分別在造模不同時(shí)間點(diǎn)(3d為一個(gè)時(shí)間單位)檢測(cè)下丘腦.垂體.腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸、下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸、下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA)血液相關(guān)激素及免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的變化。血液T
7、淋巴細(xì)胞亞群采用流式細(xì)胞儀檢測(cè);血清干擾素-γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè);血漿促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、CORT,血清總?cè)饧谞钕僭彼?T3)、總甲狀腺素(T4),血清生殖內(nèi)分泌激素(FSH、LH、E2、T、P)及下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)均采用RIA檢測(cè)。子宮雌激素受體α(ERα)表達(dá)采用免疫組化法。
8、> 4以婦科實(shí)寒證、虛寒證模型大鼠為研究對(duì)象,比較實(shí)寒證、虛寒證形成過程中機(jī)體能量代謝的異同。分別在造模不同時(shí)間點(diǎn)(3d為一個(gè)時(shí)間單位)檢測(cè)組織線粒體能量代謝及氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的變化情況。肝臟三磷酸腺苷(ATP)酶、琥珀酸脫氫酶(SDH)及乳酸脫氫酶(LDH)活性采用化學(xué)比色法,肝臟ATP含量采用高效液相法,肝糖原(Gn)含量采用蒽酮法;子宮超氧化物歧化酶(SOD)活力采用比色法,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥法;子宮解偶聯(lián)蛋白2
9、(UCP2)表達(dá)采用免疫組化法。
結(jié)果:
1實(shí)寒組與正常組比較,差異代謝產(chǎn)物有葡萄糖、果糖、木糖醇、半乳糖、異檸檬酸、馬尿酸、丙氨酸、甘氨酸8種;其中實(shí)寒組升高的有葡萄糖、果糖、木糖醇、半乳糖、異檸檬酸、馬尿酸;降低的有丙氨酸、甘氨酸。虛寒組與正常組比較,差異代謝產(chǎn)物有果糖、麥芽糖、阿拉伯呋喃糖、異檸檬酸、乳酸、馬尿酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、軟脂酸、硬脂酸、原藻醇12種;其中虛寒組升高的只有乳酸,其余均降低。實(shí)寒組
10、與虛寒組之間差異代謝產(chǎn)物有葡萄糖、果糖、異檸檬酸、乳酸、甘氨酸、原藻醇、馬尿酸7種,其中虛寒組升高的只有乳酸,其余均降低。
實(shí)寒組、虛寒組、正常組MC2生殖內(nèi)分泌激素(FSH、LH、E2、P、T)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MC2、MC7空腹血糖(FBG)及血脂指標(biāo)(TC、TG、LDL-C)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)寒組有兩例樣本MC2尿糖(±),其余尿糖均為(-)。
2模型組大鼠外觀差,被毛無光澤,耳、爪紫暗;
11、精神萎靡、蜷縮少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、喜扎堆,體重減輕,肛溫降低,便溏;動(dòng)情周期延長(zhǎng)、間期延長(zhǎng);血清FSH、LH、E2、P、IL-2及血漿CORT、cAMP/cGMP均降低,血漿cGMP升高;胸腺、脾臟、子宮、卵巢指數(shù)均降低;與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。子宮、卵巢形態(tài)異常。治療組較模型組上述指標(biāo)均有不同程度改善。
3實(shí)寒組大鼠表現(xiàn)為HPA、HPT亢進(jìn),下丘腦CRH、TRH含量上升,血漿ACTH和CORT,血清T3、T4均升高;后期
12、下丘腦CRH、TRH含量、血漿ACTH、CORT,血清T3稍下降逐漸趨于穩(wěn)定。免疫系統(tǒng),前期CD4+/CD8+、Th1/Th2降低,后期CD4+/CD8+、Th1/Th2回升。虛寒組大鼠前期HPA、HPT亢進(jìn),下丘腦CRH、TRH含量,血漿ACTH、CORT,血清T3、T4均升高;后期下丘腦CRH、TRH含量、血漿ACTH、CORT,血清T3下降;Th1/Th2、CD4+/CD8+下降。
實(shí)寒組、虛寒組均表現(xiàn)為HPOA抑制。實(shí)
13、寒組大鼠血清FSH下降明顯,15d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血清T升高,9d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其余指標(biāo)均有下降趨勢(shì),但與0d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;子宮內(nèi)膜ERα表達(dá)增強(qiáng),12d、15d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。虛寒組大鼠下丘腦GnRH含量及血清FSH、LH、E2、P均下降,27d、30d下丘腦GnRH含量及血清FSH、E2與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,30d血清LH、P與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;子宮內(nèi)膜ERα表達(dá)前
14、期有升高趨勢(shì)后期明顯降低,27d、30d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4實(shí)寒組大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活性、ATP含量增加;Na+-K+-ATP酶9d、12d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ca2+-Mg2+-ATP酶15d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;SDH活性、ATP含量12d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;子宮UCP2表達(dá)、血清FBG、FFA先升后降,UCP2表達(dá)及FBG6d與0d比
15、較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,F(xiàn)FA9d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肝Gn含量先降后升,6d與0d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血清INS、GLU、肝臟LDH活性、子宮SOD活性、MDA含量各時(shí)間點(diǎn)與0d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
虛寒組大鼠肝臟Na+-K+-ATP酶先升后降,ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活性及ATP含量前期略有升高中后期明顯降低,27d、30d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;子宮SOD活性降低,24d、27d、30d與0
16、d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肝臟LDH活性、子宮UCP2及MDA含量升高,24d、27d、30d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;FBG、FFA、GLU均先升后降,肝Gn含量以降低為主,F(xiàn)BG、GLU、肝Gn含量27d、30d與0d比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;INS各時(shí)間點(diǎn)與0d比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1實(shí)寒證痛經(jīng)患者、虛寒證痛經(jīng)患者、正常對(duì)照組尿液的差異代謝物質(zhì)涉及到糖代謝、氨基酸代謝、脂酸代謝等代謝途徑以及腸道菌
17、群的紊亂。實(shí)寒組與虛寒組的差異主要為糖代謝。
2采用延長(zhǎng)冰箱冷凍加冰水浸泡時(shí)間方法創(chuàng)建的大鼠模型成功模擬了婦科虛寒證的病因及致病特點(diǎn),結(jié)合臨床癥狀,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及藥物反證,提示該模型創(chuàng)建成功,可用于婦科虛寒證的研究。
3 NEI調(diào)控變化是寒證發(fā)生的機(jī)制之一,也是機(jī)體表現(xiàn)出實(shí)寒、虛寒不同證候的機(jī)制之一。實(shí)寒組、虛寒組前期均以亢進(jìn)為主,實(shí)寒組逐漸適應(yīng)建立新平衡。虛寒組最終轉(zhuǎn)為衰竭導(dǎo)致機(jī)體免疫低下及病理性損傷。
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