短帚霉的形態(tài)學觀察及致病性的動物實驗研究.pdf

1、目的：短帚霉是一種腐生性條件致病真菌，通常引起甲真菌病，較少引起其他部位的感染，但目前國外已經(jīng)有關于深部組織感染的報道。此菌分離于該科門診病人，經(jīng)中國醫(yī)學科學院微生物研究所鑒定為Scopulariopsis brevicaulis。 本研究一方面通過對短帚霉形態(tài)學觀察，進一步了解短帚霉的形態(tài)學特征與產(chǎn)孢方式，為臨床上診斷短帚霉病提供指導；另一方面，通過動物實驗檢測其引起系統(tǒng)性感染的可能性，并且觀察不同免疫狀態(tài)下動物的死亡情況，同

2、時對自然死亡和分期處死的小鼠進行解剖，通過鏡檢、組織逆培養(yǎng)、組織病理學檢查、組織載菌量測定等方法比較各臟器的感染程度。為進一步了解此菌的致病力和引起的病理形態(tài)學改變提供實驗室依據(jù)。 方法： 1.DNA序列分析提取分離菌DNA，PCR擴增其26SrDNA近5'端D1/D2區(qū)域，在DNA自動測序儀上進行直接雙向測序確定堿基位點，通過GenBank/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列檢索，通過系統(tǒng)樹顯示其親緣

3、關系。 2.菌株的形態(tài)學觀察 2.1大體菌落觀察將我科保存菌株復溫24h，轉種于SDA培養(yǎng)基上，37℃和27℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長情況。 2.2光鏡觀察取其菌落標本置于載玻片上，10％KOH溶液溶解后，蓋上蓋玻片，光鏡下觀察。 2.3掃描電鏡觀察取兩個溫度下培養(yǎng)10天的菌落標本，置于4％的戊二醛中固定，常規(guī)制片后在掃描電鏡下觀察。 3.動物的致病性試驗 3.1短帚霉系統(tǒng)感染動物模型

4、的制作將保存菌株復溫，轉種于SDA培養(yǎng)基上27℃培養(yǎng)10天。用無菌生理鹽水制備成菌懸液，通過皮下、腹腔、靜脈三種途徑接種至不同免疫狀態(tài)的小鼠。 3.2死亡率的觀察連續(xù)觀察各組小鼠感染該菌后四周內的自然死亡情況，記錄死亡日期和死亡只數(shù)。 3.3感染內臟的大體觀察將不同感染時間的動物解剖。分別取出心、肝、脾、肺、腎，觀察各臟器是否腫大或萎縮、有無顏色變化等。 3.4直接鏡檢肉眼可見感染灶的臟器取膿灶處小塊組織，壓碎后

5、于光學顯微鏡下直接鏡檢。 3.5組織逆培養(yǎng)各臟器用組織研磨器研碎后挑取少許分別接種于沙堡氏試管培養(yǎng)基，27℃溫箱培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況，然后挑取菌落制成濕片在光學顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。 3.6組織病理學檢查取各臟器表面肉眼可見病理改變組織，用10％福爾馬林溶液常溫固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，HE和PAS染色，光鏡下觀察組織病理學變化。 3.7腎臟載菌量(CFU)的測定單側腎臟用組織研磨器研碎后，加無

6、菌生理鹽水1ml混勻，取10μl組織懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面，27℃溫箱中培養(yǎng)，48小時后讀取平皿表面的菌落數(shù)。 結果： 1.DNA序列分析結果基于26SrDNA D1/D2區(qū)序列和Neighbor-Joining分析繪制的系統(tǒng)樹，示該菌株與Scopulariopsis brevicaulis是近緣種的關系。 2.大體菌落觀察培養(yǎng)3～4天，菌落開始生長，初為白色膜樣菌落，生長迅速，以后變?yōu)榛液稚?3

7、.光鏡下觀察可見分枝分隔菌絲，帚狀枝，分生孢子自環(huán)孢子梗長出一串，呈球形，壁厚，表面光滑或粗糙。 4.掃描電鏡觀察可見帚狀枝，菌絲末端或側面著生球形的分生孢子。 5.動物模型腹腔和靜脈注射途徑感染小鼠，真菌培養(yǎng)陽性，組織病理學檢查可見大量菌絲和少數(shù)的孢子。皮下接種各臟器真菌培養(yǎng)和組織病理學改變均呈陰性。 6.自然死亡情況免疫抑制靜脈組在接種后第2天開始出現(xiàn)死亡，第3天達到死亡高峰，死亡率高到93.3％。免疫抑制腹

8、腔組在接種該菌后3天開始出現(xiàn)死亡，第7天達到高峰，至2周止，死亡率為53.3％。其余各組均無自然死亡。 7.內臟的大體改變見到肝脾腫大，或萎縮，呈紫紅色。部分死亡小鼠的肺明顯萎縮，呈粉色或白色。 8.直接鏡檢可見大量分枝分隔菌絲，圓形孢子。 9.組織逆培養(yǎng)三天后可見部分臟器長出菌落。 10.病理學變化蘇木精.伊紅染色早期為急性炎細胞浸潤，可見組織細胞壞死，后期可見組織細胞及多核細胞反應性增生。PAS染色可

9、見紫紅色的菌絲和圓形孢子。 11.腎臟載菌量(CFU) 無論免疫正常還是免疫抑制狀態(tài)下，靜脈注射組腎臟感染程度較腹腔組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異；免疫抑制腹腔注射組腎臟感染程度較免疫力正常腹腔注射組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異；免疫抑制靜脈注射組腎臟感染程度較免疫力正常靜脈注射組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異。 結論： 1.短帚霉只有絲狀型一種菌落形態(tài)，可見豐富的分枝分隔菌絲，有帚狀枝，分生孢子由環(huán)孢子梗產(chǎn)生一串

10、，呈球形，壁厚，表面光滑或粗糙有刺，為短帚霉的形態(tài)學特征。環(huán)痕產(chǎn)孢為其產(chǎn)孢方式。 2.通過腹腔和靜脈注射途徑可以成功建立短帚霉系統(tǒng)性感染小鼠模型。皮下注射接種則不能致系統(tǒng)性感染。 3.免疫力低下狀態(tài)更易引起感染，感染的程度也更重。但當進入體內的菌量較大時也可引起免疫力正常的小鼠的系統(tǒng)性感染，說明此菌具有較強的致病力。 4.短帚霉引起的組織病理學改變?yōu)檎婢腥镜募甭匝装Y，并無特異性改變。 5.死亡率和腎臟