林生地霉的形態(tài)學觀察及體內(nèi)藥物敏感性實驗研究.pdf

1、目的：林生地霉(Geotricumsivicola)為新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見地霉。2002年，首次從巴西的果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出。同年，我科首次從一膿癬患兒皮損中分離得到一株林生地霉。2005年，我科又自一例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出一株林生地霉。李秀麗等對皮損分離株進行了初步的形態(tài)學觀察和體外藥敏試驗。 本研究一方面通過對林生地霉血液分離株的形態(tài)學觀察，進一步了解林生地霉的形態(tài)學特征與產(chǎn)孢方式，為臨床上診斷林生地

2、霉病提供指導；另一方面，應(yīng)用氟康唑、伊曲康唑、特比奈芬三種常用抗真菌藥物治療系統(tǒng)性林生地霉感染小鼠，通過對試驗小鼠中位生存時間和生存率以及心、肝、脾、肺組織的真菌逆培養(yǎng)陽性率和腎臟組織載菌量的檢測來評價它們在小鼠體內(nèi)抗林生地霉的活性，為臨床上治療系統(tǒng)性林生地霉感染提供依據(jù)。 方法：1DNA序列分析提取血液分離菌株DNA，PCR擴增其26SrDNA近5’端D1/D2區(qū)域，在DNA自動測序儀上直接雙向測序確定堿基位點，通過GenBa

3、nk/EMBL/DDBJ/PDB核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列檢索，通過系統(tǒng)樹顯示其親緣關(guān)系。 2血液分離株的形態(tài)學觀察2.1大體菌落觀察取血液分離株置常溫下復蘇，3天后轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基，37℃和27℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長情況。 2.2光鏡觀察：分別取其絲狀型和酵母樣型菌落標本置于載玻片上，10％KOH溶液溶解后，蓋上蓋玻片，光鏡下觀察。 2.3掃描電鏡觀察：取兩個溫度下培養(yǎng)一周的菌落標本，置于4％的戊二醛

4、中固定，常規(guī)制片后在掃描電鏡下觀察。 2.4透射電鏡觀察：取兩個溫度下培養(yǎng)一周的菌落標本，置于2.5％的戊二醛中固定，常規(guī)制片后在透射電鏡下觀察。 3體內(nèi)藥敏試驗3.1林生地霉系統(tǒng)感染動物模型的制作：取皮損分離株經(jīng)復蘇轉(zhuǎn)種后的菌落，用無菌生理鹽水制備成菌懸液，通過腹腔注射途徑接種至應(yīng)用環(huán)磷酰胺免疫抑制的小鼠。 3.2給藥方法接種后2h開始給藥，氟康唑、伊曲康唑、特比奈芬均為10mg/(kg.d)，腹腔注射，1天1

5、次，連續(xù)5天。 3.3生存觀察連續(xù)觀察小鼠接種后21天內(nèi)的自然死亡情況，記錄死亡日期和死亡只數(shù)。 3.4組織逆培養(yǎng)各臟器用組織研磨器研碎后挑取少許接種于沙堡氏試管培養(yǎng)基，37℃溫箱培養(yǎng)。 3.5腎臟組織載菌量(CFU)的測定腎臟組織經(jīng)研磨器研碎后，用無菌生理鹽水稀釋至1ml，取10μl組織懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面，48小時后讀取菌落數(shù)。 結(jié)果：1DNA序列分析結(jié)果血液分離株(Hebei-1)26SrD

6、NAD1/D2區(qū)序列分析，與皮損分離株(Changzheng-1)比較有1個堿基的差異，與林生地霉模式菌株比較有4個堿基的差異，鑒定為林生地霉。基于26SrDNAD1/D2區(qū)序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示Hebei-1菌株與Changzheng-1的親緣關(guān)系最近。 2大體菌落觀察培養(yǎng)第2～3天，菌落開始生長，初為白色絨毛樣、粉末樣，1～2周后菌落均轉(zhuǎn)變?yōu)槿槔覙?，其?7℃下培養(yǎng)的菌落轉(zhuǎn)變較早。 3光鏡下觀察菌絲相時，光鏡

7、下可見豐富的分支分隔菌絲、成鏈的關(guān)節(jié)孢子和圓形、橢圓形小分生孢子。酵母相時，光鏡下可見豐富的單生或串生的芽生孢子，少量的厚膜孢子、外生或內(nèi)生的關(guān)節(jié)孢子，菌絲稀少。 4掃描電鏡觀察可見菌絲分支末端或側(cè)面著生球形、棒狀的分生孢子，末端凹陷。 5透射電鏡觀察可見分生孢子與菌絲分離時全壁斷裂，另一端正在出芽。 6真菌逆培養(yǎng)結(jié)果氟康唑和伊曲康唑治療組小鼠心肺組織真菌培養(yǎng)陽性率較特比萘芬治療組和生理鹽水對照組均低，有顯著性差

8、異。余下各組中同一臟器的真菌逆培養(yǎng)陽性率比較均無差異。 7腎臟組織載菌量伊曲康唑和氟康唑治療組中小鼠的腎臟組織載菌量較特比萘芬治療組和生理鹽水對照組均有顯著減少；特比萘芬治療組中小鼠的腎臟組織載菌量較生理鹽水對照組無顯著性減少；氟康唑治療組中小鼠的腎臟組織載菌量較伊曲康唑治療組顯著減少。 結(jié)論：1林生地霉血液株有絲狀型和酵母樣型兩種菌落形態(tài)而皮損株只有酵母樣型。鏈狀排列的矩形關(guān)節(jié)孢子、橢圓形或圓形的小分生孢子以及單生或串