重組大腸桿菌高效生產(chǎn)具生物活性的人β-防御素和牛腸激酶的研究.pdf

1、人β-防御素是近來(lái)年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗菌活性并在機(jī)體抵御外來(lái)微生物入侵中起防御作用的一類(lèi)陽(yáng)離子抗菌肽.腸激酶是哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的一種絲氨酸蛋白水解酶,能夠特異性的識(shí)別(Asp)<,4>-Lys序列,起到把胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變成胰蛋白酶的作用. 本論文研究了使用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人β-防御素3及4(HBD3、HBD4)和牛腸激酶輕鏈(BEKLC)的方法.建立了從獲得HBD3、HBD4和牛腸激酶輕鏈基因、載體構(gòu)建、表達(dá)優(yōu)化、產(chǎn)物分離純化、BEK

2、LC包涵體復(fù)性,直到生物活性測(cè)定等的完整工藝. 經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化全基因合成了HBD3及4的基因,構(gòu)建了大腸桿菌融合表達(dá)HBD3及4的基因工程菌,通過(guò)對(duì)搖瓶表達(dá)條件的研究,獲得了如下的優(yōu)化培養(yǎng)條件:在:MBL培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為34℃,在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期添加終濃度為0.4 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的情況下,HBD3和HBD4重組菌分別誘導(dǎo)8 h和6h終止發(fā)酵,首次實(shí)現(xiàn)了融合蛋白的高水平表達(dá).HBD3融合蛋白的產(chǎn)量為2.55g/L,HBD4融

3、合蛋白的產(chǎn)量達(dá)到2.68 g/L. 經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化全基因合成了牛腸激酶輕鏈基因(sBEKLC),采用質(zhì)粒pET-39b(+)構(gòu)建了融合表達(dá)載體,成功地在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),融合蛋白產(chǎn)量達(dá)到151.2 mg/L,i.e.80.6 mg/L sBEKLC.使用滲透沖擊技術(shù)從細(xì)胞周質(zhì)中提取sBEKLC,經(jīng)過(guò)親和層析可從每升發(fā)酵液中得到6.8mg sBEKLC,在類(lèi)似的研究工作中處于較高的水平.經(jīng)檢測(cè),sBEKLC具有生物活性.

4、 部分表達(dá)的sBEKLC融合蛋白為不可溶,應(yīng)用鎳離子金屬螯地合層析對(duì)包涵體進(jìn)行了純化和復(fù)性研究,優(yōu)化的復(fù)性條件為:50 mM Tris-HCl(pH 8.0),0.3 MNaCl.2 M urea,10 mM Imidazole,3 mM GSH,0.6 mM GSSG條件下,復(fù)性6 h結(jié)束,復(fù)性產(chǎn)物具有生物活性. 將自制的腸激酶輕鏈成功地用于人防御素融合蛋白的切割以釋放出有生物活性的成熟的產(chǎn)物.對(duì)重組菌生產(chǎn)的人β-防御素-3