農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因抗蟲玉米的研究.pdf

1、目前在植物基因工程中常常需要轉(zhuǎn)化來源于微生物的基因。這種原核生物的基因的編碼區(qū)序列使用的密碼子多為植物使用頻率很低的稀有密碼子,這就可能導(dǎo)致基因在植物中的表達量很低。而通過密碼子優(yōu)化可以顯著地提高外源基因在植物中的表達。
　　 Bccry1Ah基因是本實驗室從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一種新型殺蟲蛋白基因,其編碼蛋白對鱗翅目害蟲的殺蟲活性強于目前使用的cry1A類基因,

2、在實驗室前期工作中已根據(jù)植物密碼子偏好性對cry1Ah基因進行過一次優(yōu)化。
　　 本研究首先利用一次優(yōu)化的cry1Ah基因構(gòu)建植物表達載體pAhmG,該載體以2raG2-epsps為篩選標(biāo)記基因,以草甘膦異丙胺鹽作為篩選劑。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系Z31幼胚,得到40株T0代轉(zhuǎn)化植株,其中14株經(jīng)分子檢測為陽性植株,對T1代植株進行了田間生物活性檢測。通過PCR、RT-PCR、Westernblot、EUSA等分子檢測結(jié)果

3、表明crylAh基因可以在玉米中表達,并穩(wěn)定遺傳。但是研究中發(fā)現(xiàn)得到的轉(zhuǎn)基因事件Cry1Ah蛋白的表達量比較低(最高僅為0.008％)并且在玉米中有降解的現(xiàn)象,這會影響到抗蟲效果。
　　 隨后,對cry1Ah基因根據(jù)玉米基因密碼子偏好性進行了二次改造,優(yōu)化后的cry1Ah基因與一次改造的基因序列相似性為75.95％。構(gòu)建了兩個分別含有crym1Ah單基因(pmAhb)、及crym1Ah/1Ie雙基因(pmAhIeb)的植物表達載

4、體,以草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(bar)為篩選標(biāo)記基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米自交系Z31幼胚,結(jié)果得到33株T0代crym1Ah基因轉(zhuǎn)化植株,其中14株經(jīng)PCR及RT-PCR檢測為陽性植株,并對T0代再生植株進行Westernblot和ELISA檢測。檢測結(jié)果顯示Cry1Ah蛋白在玉米中正確的表達,最高達到0.045％;表達量較pAhmG轉(zhuǎn)基因植株提高5-10倍左右。
　　 本研究通過密碼子優(yōu)化方法提高cryIAh基因的表達,并