DNA甲基化修飾與內源性miRNA對珠蛋白基因表達調控的研究.pdf

1、珠蛋白基因簇在個體發(fā)育中表現(xiàn)為依次表達,并具有高度的組織特異性和發(fā)育階段特異性。珠蛋白基因的轉錄受染色質結構、編碼基因與其旁側序列甲基化程度、順式調節(jié)元件及細胞內反式作用因子的調節(jié)控制。Locus control regiongs(LCRs,基因座控制區(qū))在功能上被定義為一類發(fā)育中的哺乳動物紅細胞α珠蛋白和β珠蛋白基因表達所必需的上游調控序列。LCR可提高與其相銜接的基因的表達并具有組織特異型和拷貝數(shù)依賴的功能元件,是最重要調節(jié)珠蛋白基

2、因表達的一類順式作用元件。有關珠蛋白基因組織特異性表達的各種研究和理論模型中,都暗示了珠蛋白表觀遺傳修飾在調控珠蛋白基因的特異性表達中的重要功能。由于缺乏合適的實驗模型,以往有關組蛋白修飾與珠蛋白基因表達關心的研究大多在細胞系中進行,因而無法重現(xiàn)珠蛋白基因的組織特異性表達。
　　 本論文利用先前構建的由LCR的HS3-2元件和β-珠蛋白基因啟動子驅動表達EGFP報告基因的小鼠模型,對DNA的差異性甲基化修飾和內源性的miRNA在

3、珠蛋白基因的特異性表達中的作用進行了研究。首先我們運用定量RT-PCR的技術檢測了報告基因在不同組織中的表達水平;在該模型小鼠呈現(xiàn)良好的組織特異性表達的基礎上,應用DNA亞硫酸鹽修飾的方法,測定了人LCR和β-珠蛋白啟動子區(qū)域在轉基因小鼠各組織中的甲基化水平差異,以揭示DNA的甲基化修飾在組織特異性表達中的作用。這部分工作獲得的主要進展是:1.以人珠蛋白基因的LCR和啟動子驅動表達EGFP的轉基因小鼠在紅系組織中高效表達人珠蛋白基因,是

4、在活體水平研究珠蛋白基因表達調控的良好模型;2.運用亞硫酸鹽測序的方法,對轉基因小鼠不同組織中珠蛋白基因的LCR和啟動子區(qū)的CpG的甲基化狀態(tài)進行了檢測和比較。結果證實,對應的CpG位點在6種紅系組織和非紅系組織中的甲基化程度和模式有顯著差異。對于區(qū)域的甲基化程度,紅系組織中較非紅系組織中低,而這種較低的甲基化修飾與報告基因EGFP的活躍轉錄對應;3.運用定量RT-PCR技術,對三種DNA甲基化酶在轉基因小鼠各組織內的表達進行了比較分析

5、。結果顯示,“起始性”(de novo)的Dnmt3a和Dnmt3b在紅系組織和非紅系組織中的表達模式有顯著差異,而“維持性”(maintenance)的甲基化酶Dnmt1的表達則沒有明顯的紅系特異性。這不僅是DNA甲基化修飾影響珠蛋白基因的表達的直接證據,也說明珠蛋白基因的甲基化修飾是Dnmt3a和Dnmt3b作用的結果;4珠蛋白基因的啟動子甲基化存在偏愛性,有若干個甲基化化敏感位點。這些位點是一些轉錄因子的調節(jié)區(qū)域。表觀遺傳修飾可能

6、是作用于轉錄因子和DNA的結合來調節(jié)珠蛋白基因的表達。
　　 為了探討轉基因小鼠報告基因EGFP組織特異性表達是否與內源性miRNA的功能相關,本研究對靶向作用于人珠蛋白基因的內源性的miRNA進行了初步研究。應用生物信息學和實驗驗證的方法,找到了針對珠蛋白基因3’UTR區(qū)的25個小鼠內源性miRNA,并對其中5個miRNA進行了較深入的分析。結果顯示,miR-34c和miR-379與組織中EGFP mRNA及Dnmt3a和Dn