Zdhhc15b及bupropion在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用及其機制的研究.pdf

1、對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，多肽鏈翻譯后還要進行多種加工修飾才具備生物學活性。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的主要方式有:磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化等等。棕櫚酰化作為脂質(zhì)化修飾方式的一種，其功能是由DHHC蛋白質(zhì)執(zhí)行的。DHHC蛋白最早是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的，正向遺傳篩選結(jié)果表明Erf2/Erf4和Akr1是酵母中的DHHC蛋白，都富含特征性鋅指樣(Zinc finger)-DHHC(Aspartate-histidine-histidine-cysteine)

2、結(jié)構(gòu)域，負責RAS2和酵母酪蛋白激酶2的修飾。除了在酵母已確定的7種DHHC蛋白，哺乳動物已發(fā)現(xiàn)23種DHHC家族成員，這些DHHC蛋白又被細分為不同的亞家族。
　　此外，隨著生活節(jié)奏的加快，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升。雖然人類在抑郁癥的研究方面付出了大量的努力，但對其發(fā)病機制仍知之甚少。同時，抗抑郁藥發(fā)揮其治療作用的分子和細胞機制尚未給出很好的解釋。早期關(guān)于抑郁癥的病理生理學假說是基于主要的神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色氨(5-hydroxy t

3、ryptamine，5-HT)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)的釋放減少。因此，5-羥色氨和去甲腎上腺素成為目前抑郁癥治療的措施和藥物開發(fā)的主要目標。但隨著神經(jīng)生物學的發(fā)展，簡單的神經(jīng)遞質(zhì)學說無法解釋抑郁癥的發(fā)病機制。最近，神經(jīng)元的神經(jīng)生成作用的降低為抑郁癥提供了嶄新的生物學和細胞學研究基礎(chǔ)。有研究表明抗抑郁藥可能會促進神經(jīng)元再生增加細胞數(shù)目從而達到治療抑郁癥的目的，但具體的作用機制還尚未明確。
　　本實驗用斑

4、馬魚作為模式動物，同時探討了DHHC家族成員Zdhhc15b以及抗抑郁藥物bupropion在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用及機制。
　　第一章 Zdhhc15b基因調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎間腦多巴胺能神經(jīng)元分化的研究
　　目的：
　　DHHC15(zinc finger DHHC-type containing15)是哺乳動物23種DHHC蛋白中的第15號成員。該基因是由332個氨基酸組成的跨膜蛋白，具有四個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個DHH

5、C(Aspartate-histidine-histidine-cysteine)-CRD(Cysteine richdomain)特征結(jié)構(gòu)域。與其他成員相比，目前對DHHC15的研究報道還比較少，且停留于體外水平。據(jù)報道，DHHC15與X連鎖精神發(fā)育遲滯相關(guān)，且DHHC15可以修飾相應的神經(jīng)蛋白，這提示DHHC15在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起到重要作用。但是，DHHC15在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的功能和機制尚不明確。分析斑馬魚DHHC基因發(fā)現(xiàn)Zdh

6、hc15b與哺乳動物DHHC15同源且兩者編碼的氨基酸序列高度保守。因此，本研究利用斑馬魚作為模式動物，通過注射morpholino建立人類DHHC15的同源基因Zdhhc15b的下調(diào)模型，利用斑馬魚胚胎整封原位雜交(Whole-mount in situ hybridization，WISH)、整封免疫熒光、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、免疫組化、行為學檢測等方法研究Zdhhc15b對斑

7、馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，并深入探討了其在斑馬魚間腦多巴胺能神經(jīng)元（dopaminergic neurons，DA neuron）分化中的作用及其機制。
　　方法：
　　首先，為了了解Zdhhc15b在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達模式，本課題設計了Zdhhc15b的特異性引物及地高辛標記的反義RNA探針，利用RT-PCR和原位雜交(whole-mount in situ hybridization，WISH)技術(shù)檢測Zdhhc1

8、5b在斑馬魚胚胎發(fā)育各時期的表達以及分布情況。原位雜交結(jié)果顯示，Zdhhc15b是母源性表達，并且從18hpf到48hpf, Zdhhc15b大量存在于腦區(qū)，尤其是間腦。RT-PCR實驗結(jié)果顯示Zdhhc15b的表達從75％外包期開始增加，18hpf到72hpf逐漸達到峰值。提示Zdhhc15b可能在斑馬魚間腦發(fā)育中的特定階段發(fā)揮重要作用。
　　多巴胺能神經(jīng)元（dopaminergic neuron，DA neuron），作為脊椎

9、動物間腦的重要組成部分，在認知、運動控制和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。Zdhhc15b下調(diào)表達引起的間腦發(fā)育缺陷和學習認知障礙促使本課題進一步研究Zdhhc15b在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中的潛在作用。酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(dopamine transporter，DAT)是多巴胺能神經(jīng)元的特異性標記物。
　　結(jié)果：
　　Zdhhc15b下調(diào)前后多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的增殖周期

10、與對照相比無明顯變化。因此推斷，Zdhhc15b對多巴胺能神經(jīng)元前體細胞的增殖沒有影響;多巴胺能神經(jīng)元前體細胞增殖的結(jié)果就是多巴胺前體神經(jīng)元的增加，ngn1是多巴胺能神經(jīng)元的標記物。
　　結(jié)論：
　　本課題使用斑馬魚作為模式生物，首次研究了Zdhhc15b在斑馬魚體內(nèi)的時空表達模式。結(jié)果顯示，Zdhhc15b在斑馬魚間腦高表達，并呈現(xiàn)階段特異性。注射嗎啉代寡核苷酸建立Zdhhc15b下調(diào)模型，發(fā)現(xiàn)Zdhhc15b下調(diào)導致斑馬

11、魚腹側(cè)間腦區(qū)域成熟的多巴胺能神經(jīng)元減少，從而導致間腦發(fā)育缺陷以及相應的學習認知障礙。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)斑馬魚Zdhhc15b表達影響斑馬魚腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元的分化。Zdhhc15b下調(diào)后foxA2，lmx1a和pitx3表達量降低。由此得出結(jié)論，Zdhhc15b可能通過Shh和Wnt/β-catenin信號通路召募一系列的多巴胺能神經(jīng)元分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子影響多巴胺能神經(jīng)元分化。也就是說通過調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的分化，Zdhhc15b

12、充當決定性因素，調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元前體細胞向成熟多巴胺能神經(jīng)元命運的轉(zhuǎn)化。本研究加深了對DHHC蛋白家族在神經(jīng)發(fā)育中功能的理解，同時為多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育的研究，特別是為多巴胺能神經(jīng)元功能障礙引起的疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ团两鹕喜〉壬窠?jīng)系統(tǒng)疾病）的研究和臨床治療提供了新的線索。
　　第二章 bupropion對斑馬魚腹側(cè)間腦多巴胺能神經(jīng)元的增殖和保護作用
　　目的：
　　抑郁癥是一種常見的具有高發(fā)病率、高復發(fā)率和高致殘率

13、等特點的精神疾病。抑郁癥發(fā)病率近年來有逐漸增高的趨勢，在普通人群中的發(fā)病率男性為5％～12％，女性為10％～25％。抑郁癥已經(jīng)成為威脅人們心身健康的一大隱患。
　　Bupropion是一種氨基酮類新型抗抑郁藥物。隨著對bupropion的深入研究也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其在戒煙、改善酒精依賴、注意缺陷多動障礙(attention deficithyperactive disorder，ADHD)等疾病方面的治療作用。盡管有這些重要進展，其作用

14、機制尚未完全了解。此外，有研究表明抗抑郁藥可能會通過促進神經(jīng)元再生增加神經(jīng)元數(shù)目達到治療抑郁癥的目的。眾所周知，多巴胺能神經(jīng)元與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，那么bupropion對多巴胺能神經(jīng)元有什么作用，其機制是什么是本課題研究的科學問題。
　　本研究用斑馬魚作為模式生物，建立多巴胺能神經(jīng)元的MPTP（1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）損傷模型，分別從體內(nèi)、體外兩個方面

15、通過胚胎整封原位雜交(Whole-mount in situ hybridization，WISH)、整封免疫熒光、細胞免疫組化、行為學檢測等方法研究了bupropion對斑馬魚多巴胺能神經(jīng)元的作用，并深入探討了其機制。
　　方法：
　　為了檢測bupropion對多巴胺能神經(jīng)元是否有作用，本課題首先建立了多巴胺能神經(jīng)元的MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MP

16、TP)損傷模型。實驗分為對照組、MPTP(5μg/mL)、bupropion（100、300μM）+MPTP組。
　　鑒于bupropion處理后TH+/DAT+神經(jīng)元的數(shù)目的增加，這促使本文檢測定bupropion對多巴胺能神經(jīng)元是否有保護作用。為此，在斑馬魚胚胎發(fā)育24hpf和48hpf時期進行吖啶橙染色實驗。結(jié)果顯示，與對照組相比，MPTP損傷組的多巴胺能神經(jīng)元凋亡數(shù)目增多，而bupropion處理組的多巴胺能神經(jīng)元的凋亡數(shù)

17、目比MPTP損傷組明顯減少。提示bupropion對多巴胺能神經(jīng)元具有保護作用。
　　結(jié)論：
　　抑郁癥發(fā)病機制及抗抑郁藥物主要治療機制目前還不清楚，而且由于缺乏人類臨床研究，這是目前面臨的一個重大科學問題。本研究發(fā)現(xiàn)bupropion具有保護和促進多巴胺能神經(jīng)元再生的作用，這將深化人們對bupropion作為抗抑郁藥物的治療機制的認識。同時，bupropion對多巴胺能神經(jīng)元的再生可能為抑郁癥或相關(guān)精神疾病的治療提供新的靶