孕期-哺乳期砷暴露對仔代中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響及毒作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：慢性砷中毒是一個影響數(shù)百萬人健康的世界性公共衛(wèi)生問題。我國飲水型砷中毒病區(qū)高砷暴露人群接近300萬，已成為受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國家之一。慢性砷中毒可致消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚等組織器官的病理損害，甚至導(dǎo)致癌癥和死亡。由于神經(jīng)細(xì)胞不能再生及其對毒物的毒性作用較其他組織細(xì)胞更為敏感，砷對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性影響日益受到高度關(guān)注。發(fā)育期機(jī)體處于快速的細(xì)胞生長和分化階段，同時對體內(nèi)毒物的清除能力較差，因此對砷的毒作用更加敏感。已被證實(shí)，

2、砷是數(shù)千種化學(xué)物中可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育紊亂的五種毒物之一。人群調(diào)查和動物實(shí)驗(yàn)均表明，砷容易通過血腦和胎盤屏障。因此，孕期砷暴露會使胎兒從宮內(nèi)發(fā)育階段，就面臨砷的神經(jīng)發(fā)育毒性作用的風(fēng)險。流行病學(xué)調(diào)查和動物實(shí)驗(yàn)均表明，腦發(fā)育期砷暴露可以導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩及出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶等高級神經(jīng)功能異常，但砷的毒作用機(jī)制尚不清楚。已知，孕期和生后早期是腦發(fā)育的關(guān)鍵時期。上述時期暴露于有害物質(zhì)可能影響神經(jīng)元的發(fā)育及正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，其機(jī)制可能與有毒化

3、學(xué)物作用于腦發(fā)育相關(guān)調(diào)控蛋白有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，Rho家族蛋白在神經(jīng)元形態(tài)形成及構(gòu)成精確的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。酒精等孕期暴露，可導(dǎo)致仔鼠腦組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建異常及學(xué)習(xí)記憶能力下降。而且已被證實(shí)，酒精的神經(jīng)發(fā)育毒性與干擾Rho家族蛋白的調(diào)控作用有關(guān)。那么，砷的神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制是否也與Rho家族蛋白對腦發(fā)育調(diào)控的紊亂有關(guān)，引起我們極大興趣。本研究通過構(gòu)建孕期及哺乳期低濃度砷暴露動物模型，觀察砷對仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的形態(tài)學(xué)及

4、對學(xué)習(xí)記憶等高級神經(jīng)功能的影響，檢測分析神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白Rho家族多個基因及蛋白的表達(dá)，探討砷對仔鼠腦組織靶基因及相關(guān)通路調(diào)控的影響，為闡明砷的神經(jīng)發(fā)育毒作用機(jī)制以及砷中毒的防治提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)構(gòu)建孕期/哺乳期砷暴露小鼠模型昆明孕小鼠隨機(jī)分為四組，孕0天起全孕期和哺乳期對母鼠以自由飲水方式染毒，含砷飲水中As2O3濃度分別為1mg/L、4mg/L和16mg/L，對照組飲用蒸餾水。仔鼠生后3周斷乳。<

5、br>　　 (2)仔鼠腦組織病理學(xué)觀察
　　 取新生仔鼠（出生3天）和斷乳仔鼠（出生3周）腦組織，石蠟包埋，切片，HE染色，以倒置相差熒光顯微鏡觀察仔鼠腦發(fā)育的形態(tài)學(xué)變化;采用生長相關(guān)蛋白(Gap-43)免疫組化法觀察仔鼠大腦神經(jīng)元突起發(fā)育。
　　 (3)仔鼠神經(jīng)行為測試
　　 以Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)測試仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 (4)仔鼠腦組織神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的基因芯片檢測。
　　

6、 (5)仔鼠腦組織Rho家族蛋白、基因表達(dá)測定
　　 Real-timeRT-PCR和Western-blot技術(shù)對新生仔鼠和斷乳仔鼠腦組織Rho家族多個基因及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：
　　 （一）孕期/哺乳期砷暴露對仔鼠腦發(fā)育影響
　　 HE染色切片的鏡下觀察顯示，與對照組比較，染砷新生仔鼠和斷乳仔鼠發(fā)育中大小腦皮層變薄，小腦外顆粒細(xì)胞層和蒲肯野細(xì)胞層厚度均顯著低于對照組(p＜0.05);染砷

7、新生仔鼠海馬出現(xiàn)錐體細(xì)胞水腫、核濃縮、錐體細(xì)胞層變薄、錐體細(xì)胞層數(shù)減少等改變;染砷斷乳仔鼠海馬出現(xiàn)錐體細(xì)胞密集、層次減少、錐體細(xì)胞層變薄、神經(jīng)氈空隙增大等改變。
　　 （二）孕期/哺乳期砷暴露對仔鼠腦神經(jīng)元軸突發(fā)育的形態(tài)學(xué)影響
　　 Gap-43免疫組化法觀察顯示，與對照組比較，染砷新生仔鼠大腦皮層錐體細(xì)胞體積變小、軸突數(shù)目減少、形態(tài)細(xì)小，神經(jīng)氈染色不均，出現(xiàn)空隙。隨染毒劑量增加，染砷斷乳仔鼠大腦皮層錐體細(xì)胞軸突數(shù)目和樹

8、突分枝逐漸減少，神經(jīng)氈著色不均勻，尤其在高劑量組呈現(xiàn)空網(wǎng)狀。提示，孕期及哺乳期砷暴露可導(dǎo)致仔鼠大腦神經(jīng)元發(fā)育遲緩，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建不良。
　　 （三）孕期/哺乳期砷暴露對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響
　　 Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)結(jié)果顯示，4mg/L和16mg/L染砷組仔鼠的逃避潛伏期顯著長于對照組(P＜0.05)。將平臺隱藏后各組小鼠逃避潛伏期之間均沒有顯著性差異，而平臺露出水面后，16mg/L染砷組仔鼠逃避潛伏期顯著長于對

9、照組、1mg/L和4mg/L染砷組(p＜0.05)。
　　 （四）孕期/哺乳期砷暴露對仔鼠腦發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因、蛋白表達(dá)影響基因芯片結(jié)果顯示，與對照組比較，4mg/L染砷組仔鼠腦組織RhoA、Rac1和Cdc42基因的表達(dá)顯著上調(diào)，RhoA/Rac1比值和RhoA/Cdc42比值均1大于1。Rho下游效應(yīng)因子Creb和Arp的編碼基因表達(dá)顯著下調(diào)。Cbln4、Chd5和Gjb1的表達(dá)顯著上調(diào)，Ncam、Crim、Fgf14、Gri

10、k2、Rnf103、Rps6ka3和Sim1的表達(dá)顯著下調(diào)。Real-timeRT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果顯示，染砷新生仔鼠腦組織RhoA和Rac1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降，而染砷斷乳仔鼠腦組織RhoA和Rac1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高。尤其，RhoA/Rac1mRNA和蛋白表達(dá)的比值，在染砷新生仔鼠和斷乳仔鼠均隨染砷劑量增加而升高。與對照組比較，染砷仔鼠生后這兩個時段腦組織Cdc42的mRNA和蛋白表達(dá)均無

11、顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 (1)孕期/哺乳期砷暴露可導(dǎo)致仔鼠大腦和小腦神經(jīng)元及其突起的形態(tài)學(xué)異常改變;
　　 (2)孕期/哺乳期砷暴露可導(dǎo)致仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降;
　　 (3)孕期/哺乳期砷暴露導(dǎo)致仔鼠腦神經(jīng)元及其突起的形態(tài)學(xué)改變可能是砷導(dǎo)致仔鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降的神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ);
　　 (4)孕期/哺乳期砷暴露能顯著下調(diào)新生仔鼠腦組織RhoA和Rac1基因和蛋白表達(dá);
　　 (5)孕