磁性納米人工內(nèi)切酶的研制和應(yīng)用.pdf

1、化學(xué)小分子與生物大分子的相互作用，尤其是人工核酸定位切斷試劑對(duì)DNA的切斷在DNA序列測(cè)定、染色體分析、基因治療以及DNA重組方面有著廣泛的用途，因此進(jìn)行人工合成限制性內(nèi)切核酸酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，隨著納米技術(shù)向生命科學(xué)領(lǐng)域的不斷滲透，利用納米技術(shù)研究和解決生命科學(xué)領(lǐng)域中的重大問(wèn)題，推動(dòng)納米生物技術(shù)的發(fā)展，正成為當(dāng)前重要的前沿研究領(lǐng)域之一。本論文在這兩者的交叉領(lǐng)域進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并取得了以下幾個(gè)有意義的結(jié)果。

2、 (1)一般人工核酸定位切斷試劑由識(shí)別和切割系統(tǒng)兩個(gè)系統(tǒng)構(gòu)成。本文中，我們采用PNA作為識(shí)別系統(tǒng)，Ce(Ⅳ)配合物切割系統(tǒng)，合成了PNA-Ce(Ⅳ)配合物人工核酸定位切斷試劑(人工核酸酶)，并用MALDl-TOF質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行了表征，運(yùn)用熒光光譜法研究了該識(shí)別系統(tǒng)PNA與其部分互補(bǔ)的靶標(biāo)26mers單鏈DNA(ssDNA)的雜交，用PNA-Ce(Ⅳ)配合物人工核酸酶在生理?xiàng)l件下對(duì)靶標(biāo)26mersssDNA進(jìn)行了定位切斷，并用離子

3、對(duì)反相高效液相色譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了分析，試驗(yàn)結(jié)果表明該試劑對(duì)靶標(biāo)ssDNA的定位切斷取得了滿意的效果。 (2)其后，我們通過(guò)共價(jià)鍵合的方法將將PNA探針連接到磁性納米粒子表面(MNPs)，并將其與靶標(biāo)DNA進(jìn)行了雜交。同時(shí)，建立了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)PNA在磁性納米粒子表面的鍵合及其與靶標(biāo)DNA的雜交過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：建立的方法是有效的；PNA探針已成功地鍵合到磁性納米粒子的表面，并且仍然有很好的生物活性

4、。 (3)將以寡聚核苷酸(ODN)為識(shí)別系統(tǒng)的人工核酸定位切斷試劑共價(jià)鍵合到磁性納米的表面，得到了基于磁性納米粒子的ODN人工核酸切割試劑(即ODN磁性納米人工內(nèi)切酶)，其后我們利用其對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行了定位切斷實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該ODN磁性納米人工內(nèi)切酶在合適的條件下，能夠迅速有效的對(duì)靶標(biāo)DNA進(jìn)行切斷，且切斷位點(diǎn)與理論預(yù)期的一致。隨后，我們嘗試以類似的方法將PNA核酸定位切割試劑連接到磁性納米粒子上，制成了基于磁性納米粒子