布氏白僵菌遺傳轉化體系的建立及穩(wěn)定高效表達Pr1蛋白酶工程菌株的構建.pdf

1、白僵菌(Beauveria)是應用和研究最廣的昆蟲病原真菌之一，也是目前微生物農(nóng)藥的研究熱點之一。白僵菌對害蟲致病性強、對環(huán)境適應性強、殺蟲范圍廣，不傷害其他天敵昆蟲和有益生物，可以有效地與其它殺蟲因子協(xié)同作用并維持物種的多樣性，容易大量生產(chǎn)、無殘毒、害蟲不產(chǎn)生抗性，相對于傳統(tǒng)化學農(nóng)藥，有著無可比擬的優(yōu)勢。但作為一種昆蟲病原真菌，白僵菌同時也存在著殺蟲速度慢、效率低、防治效果不穩(wěn)定等缺點，大大影響了其殺蟲效果。昆蟲病原真菌通過體壁接觸感

2、染導致害蟲死亡，在侵染昆蟲體壁過程中分泌一系列胞外水解酶如蛋白酶、幾丁質酶、脂肪酶、纖維素酶等，形成一個相互作用的復雜體系，降解昆蟲體壁并主動引起昆蟲致病直至死亡。其中，類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like protease，Prl)在降解昆蟲體壁并激活昆蟲免疫自毒體系，引起害蟲致病過程中起主要作用，是其重要的毒力因子。已有研究證實，通過增加Prl基因的拷貝數(shù)，提高表達水平，并改變其為組成型表達模式，可明顯提高轉化體的殺蟲毒

3、力。 利用基因工程技術對菌株進行改良，構建高酶活高抗性的白僵菌工程菌，提高毒力因子的活性，并加強白僵菌致病分子機理的研究，對充分實現(xiàn)該菌的生物防治作用具有重要意義。目前，國內(nèi)外對白僵菌表皮降解蛋白酶基因的研究主要集中在對球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的研究上，而對布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)表皮降解蛋白酶基因的研究未見報道。由于布氏白僵菌侵染昆蟲有其特定的寄主譜，因而有必要開展

4、布氏白僵菌殺蟲毒力分子生物學的研究。 本課題在本實驗室前期克隆得到的布氏白僵菌Prl蛋白酶基因序列和cDNA序列的基礎上展開。主要內(nèi)容包括： ①根據(jù)布氏白僵菌Prl基因全長cDNA序列設計引物，以含有Prl基因全長cDNA的質粒pGEM-T-PrlcDNA為模板，PCR擴增得到含有Prl基因ORF序列的DNA片段。構建了重組質粒pBV220-PrlcDNA ORF(6XHis)，并導入大腸桿菌XLOLR。通過重組Prl

5、蛋白酶包涵體純化和變性溶解，鎳離子螯和柱純化，透析復性等一系列處理，酶活測定結果表明，成功實現(xiàn)了布氏白僵菌Prl蛋白酶基因在Ecoli中的表達，其比酶活為0.288 Umg<'-1>蛋白。 ②建立了根瘤農(nóng)桿菌介導的布氏白僵菌遺傳轉化體系。將草丁磷除草劑抗性bar基因作為篩選標記，構建了含絲狀真菌組成型bar基因表達元件的根瘤農(nóng)桿菌Ti質粒，建立了根瘤農(nóng)桿菌雙元載體體系，并對影響轉化效率的主要因素布氏白僵菌孢子濃度，根瘤農(nóng)桿菌與

6、布氏白僵菌孢子共培養(yǎng)時間及誘導轉化的乙酰丁香酮(下簡稱AS)的濃度三個限制條件進行了優(yōu)化。確定根瘤農(nóng)桿菌介導布氏白僵菌遺傳轉化條件為：根瘤農(nóng)桿菌與布氏白僵菌共培養(yǎng)混合物中自僵菌分生孢子濃度為10<'5>個/ml，AS濃度為400μmol/L，共培養(yǎng)時間48 hour。根瘤農(nóng)桿菌介導布氏白僵菌遺傳轉化體系得建立，為從基因水平，利用分子生物學手段對布氏白僵菌進行改造，得到穩(wěn)定高效的殺毒工程菌株奠定了基礎。③實現(xiàn)了昆蟲病原真菌的重要毒力因子—

7、—類枯草桿菌蛋白酶Prl在布氏白僵菌中的組成型超表達。將Prl基因連接在組成型勾巢曲霉三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子下，并在Ti質粒PROK Ⅱ上的T-DNA左右邊界之間插入bar基因和Prl基因組成型表達框，轉化出發(fā)菌株為國家產(chǎn)業(yè)化示范菌株布氏白僵菌1019，實現(xiàn)prl蛋白酶基因的在其染色體上的整合。在非誘導培養(yǎng)條件下的酶活測定結果表明，重組菌株的比酶活約為15U mg<-1>蛋白，實現(xiàn)了類枯草桿菌蛋白酶Prl的組成型表達。同時在蟬蛻誘導培