強(qiáng)旱生植物沙冬青AmDHN、AmERF基因克隆及轉(zhuǎn)化甜菜的研究.pdf

1、甜菜是世界上重要的糖料作物之一，也是我國第二大糖料作物，在我國國民生產(chǎn)總值中占有重要地位。本試驗(yàn)是在已對(duì)強(qiáng)早生植物沙冬青eDNA文庫研究的基礎(chǔ)上，通過EST序列分析和GEN-BANK核酸數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，對(duì)檢測(cè)到的34個(gè)DIN基因ESTs和15個(gè)ERF的ESTs進(jìn)行拼接得到基因全長(zhǎng)的cDNA序列，通過設(shè)計(jì)特異性引物克隆了沙冬青AmDHN基因和AmERF轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建了沙冬青AmDHN基因植物表達(dá)載體和沙冬青AmDHN基因、AmERF轉(zhuǎn)錄因子

2、及PPT抗性基因二價(jià)植物表達(dá)載體，建立了甜菜組培再生體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將沙冬青AmDHN基因?qū)胩鸩?，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果入如下：
　　 1．克隆了沙冬青脫水素(AmDHN)基因，其全長(zhǎng)為1106bp，讀碼框?yàn)?52bp，編碼183個(gè)氨基酸，理論MW=18407.4，理論pI=6.22。
　　 2．克隆了沙冬青乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子(AmERF)，其讀碼框?yàn)?33bp，編碼211個(gè)氨基酸，理論MW=23216.0

3、，理論pI=8.20。網(wǎng)絡(luò)Blastx程序比對(duì)，找到56個(gè)同源性較高的序列，其中與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻粳稻品種組(japonicacultivar-group of Oryza sativa)、辣椒(Capsicum annuum)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的一致性分別達(dá)到83％、72％、74％和61％。
　　 3．利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)AmDHN基因的1個(gè)堿基進(jìn)行了

4、定點(diǎn)突變，成功地將其堿基序列CCATGG突變?yōu)镃TATGG。
　　 4．構(gòu)建了沙冬青的AmDHN基因植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-DHN與AmDHN基因、AmERF轉(zhuǎn)錄因子的二價(jià)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-DHN、AmERF，為今后進(jìn)一步研究沙冬青抗逆基因的表達(dá)規(guī)律及代謝調(diào)控等提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也豐富了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物抗逆性的基因庫。
　　 5．建立了以甜菜葉柄為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，篩選出誘導(dǎo)叢生

5、芽能力較高的甜菜基因型材料4個(gè)(N98122、N9849、HBB-1和內(nèi)甜單1)，分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基2種(MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L；MS+NAA0.5mg/L+KT3.0mg/L)，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基1種(MS+NAA2.0mg/L)。
　　 6．采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法并結(jié)合真空輔助侵染將脫水素基因?qū)肓颂鸩?，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)基因植株107株，PPT抗性檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株具有很強(qiáng)的PPT抗性，干旱脅迫試驗(yàn)結(jié)