熱激脅迫與外源基因誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞編程性死亡的機(jī)制初探.pdf

1、河南大學(xué)碩士學(xué)位論文熱激脅迫與外源基因誘導(dǎo)煙草懸浮細(xì)胞編程性死亡的機(jī)制初探姓名：申志發(fā)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：宋純鵬;董發(fā)才20000601河南大學(xué)碩士學(xué)位論文胞中得到高效表達(dá)。但由于動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在著較大的差異。為探討雞貧血病毒V F ，基因在植物細(xì)胞的表達(dá)，以及進(jìn)一步研究V P ，蛋白在植物細(xì)胞中的分布、生物學(xué)功能．我們構(gòu)建了含V P ，基因的植物細(xì)胞表達(dá)載體。植物細(xì)胞中間表達(dá)載體p B I

2、l 2 l 質(zhì)粒，為取元載體系統(tǒng)t p的微型T i 質(zhì)粒( m i n i ．T iP l a s m i d ) ，P B l l 2 l 質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)( M C S ) 可供外源基因的插入，在其57 端上游為花椰菜花葉病毒D N A 的C a M V 3 5 S 啟動(dòng)子，在多克隆位點(diǎn)37 端為胭脂堿合成酶( N O S ) 基因3 ’端的非編碼區(qū)域，這樣的結(jié)構(gòu)可為外源基因提供足夠強(qiáng)大的起始和終止信號(hào)。當(dāng)含外源基因重組體轉(zhuǎn)化宿主

3、細(xì)胞后，可用免疫組化、熒光及分光光度法等檢測(cè)外源基因的表達(dá)。另外在p B [ 1 2 I 上還帶有用作篩選標(biāo)記的卡那霉素( k a n ) 抗性基因和B 一葡萄糖苷酸酶( G u s ) 報(bào)告基因。用I ? C R 技術(shù)擴(kuò)增p e D N A ，中V P ，基因，將獲得的外源基因和載體D N A 進(jìn)行雙酶切( X b a l ／B a m H I ) ，產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。在T 。D N A 連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接后的重組質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)入Ec o l i T G 、中利用k a n 抗性進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒采用限制酶酶切進(jìn)行鑒定分析，獲得了陽(yáng)性重組子并命名為p B l C ．35S V P 3 。純化后重組質(zhì)粒通過D N A 直接導(dǎo)入法導(dǎo)入農(nóng)桿菌L B A 4 4 0 4 ，通過抗性篩選后獲得工程菌株p B I C ．3 5 S V P 3 ／L B A4 4 0 4 。將此工程菌株轉(zhuǎn)化懸浮煙草細(xì)胞。通過S o u t h e r n d o tb l o t t i

5、 n g 分析t 結(jié)果檢測(cè)為陽(yáng)性。在不同的時(shí)間內(nèi)收獲細(xì)胞，用V P 3 基因特異的引物作逆轉(zhuǎn)錄P C R ( R T —P C R ) ，結(jié)果證實(shí)，重組的C A V —V P 3 基因在轉(zhuǎn)化4 8 h 時(shí)，發(fā)現(xiàn)有V P ，基因相應(yīng)的m R N A 轉(zhuǎn)錄，7 2 h 以后，仍能檢測(cè)到V P ，m R N A 的存在。V P ，基因轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞5 d 后進(jìn)行流式細(xì)胞儀( F A C S ) 檢測(cè)，結(jié)果表明V P 3 蛋白能夠在一定程度上促進(jìn)