DMRT家族生物信息學(xué)分析及Dmrt4-Dmrt6表達(dá)與功能初步研究.pdf

1、DMRT(DoublesexandMab-3relatedtranscriptionfactors)基因家族是一個(gè)與生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生，特別是與動(dòng)物性別決定及分化密切相關(guān)的家族。迄今為止，在無(wú)脊椎與脊椎動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)有40多個(gè)DMRT成員。該家族成員的主要特征是具有一個(gè)比較保守的DM結(jié)構(gòu)域，能識(shí)別特異的DNA序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DMRT基因在最早的多細(xì)胞腔腸動(dòng)物就已出現(xiàn)且與有性生殖相關(guān)。目前對(duì)DMRT基因在性別決定與分化中的作用研究主

2、要集中于Dmrt1，對(duì)其他成員的研究較少。為研究DMRT基因在魚類性別決定與分化及性腺發(fā)育過(guò)程中的潛在作用，我們分離了尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)所有DMRT家族成員，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、共線性及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系、性腺轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平進(jìn)行分析，并通過(guò)TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)研究Dmrt4/Dmrt6在性腺發(fā)育中的可能作用。
　　 通過(guò)性腺

3、轉(zhuǎn)錄組與基因組結(jié)合，我們?cè)谀崃_羅非魚中分離到7個(gè)DMRT成員，分別是Dmrt1、Dmrt2a、Dmrt2b、Dmrt3、Dmrt4、Dmrt5和Dmrt6。其中Dmrt2a與Dmrt2b是一種復(fù)制，Dmrt2b在四足類不存在，我們推測(cè)Dmrt2b可能為魚類特有。首次發(fā)現(xiàn)Dmrt6也存在于真骨魚中，但目前僅從麗魚科中分離到，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能有兩個(gè):一是Dmrt6在其他魚類發(fā)生了次生性的丟失;二是基因組測(cè)序不完全而沒(méi)有分離到Dmrt6

4、。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚Dmrt6與哺乳類Dmrt6相似度高達(dá)60％以上。系統(tǒng)發(fā)生及共線性分析表明尼羅羅非魚所有DMRT基因是四足類的同源基因。通過(guò)8個(gè)性腺轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚有5個(gè)DMRT成員在性腺中表達(dá)，其中Dmrt1、Dmrt5和Dmrt6在雄性中的表達(dá)高于雌性，Dmrt2a和Dmrt4在雌性中的表達(dá)高于雄性。
　　 本研究通過(guò)RT-PCR、Real-timePCR、原位雜交與免疫組化等技術(shù)分析了尼羅羅非魚Dm

5、rt4/Dmrt6的表達(dá)模式。組織表達(dá)模式表明Dmrt4除主要表達(dá)于卵巢外，還在鰓和肌肉中少量表達(dá);Dmrt6除主要表達(dá)于精巢外，還在腦、垂體等組織中表達(dá)。Real-timePCR分析表明在正常性腺中，Dmrt4和Dmrt6分別在70dah(daysafterhatching)卵巢與90dah精巢中開始高表達(dá);Dmrt4在Fadrozole誘導(dǎo)原發(fā)性逆轉(zhuǎn)雄性(XX)性腺中的表達(dá)低于正常雌性，而在雌二醇(E2)誘導(dǎo)原發(fā)性逆轉(zhuǎn)雌性(XY)性

6、腺中的表達(dá)高于正常雄性;Dmrt6在Fadrozole誘導(dǎo)原發(fā)性逆轉(zhuǎn)雄性(XX)性腺中的表達(dá)高于正常雌性，在雌二醇(E2)誘導(dǎo)原發(fā)性逆轉(zhuǎn)雌性(XY)性腺中的表達(dá)低于正常雄性;由此可見羅非魚Dmrt4和Dmrt6的表達(dá)均與表型相關(guān)。原位雜交與免疫組化分析均表明Dmrt4主要在一、二時(shí)相卵母細(xì)胞中表達(dá)，Dmrt6主要在精母細(xì)胞中表達(dá)。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚Dmrt4不能調(diào)控雌激素合成酶Cyp19a1a的轉(zhuǎn)錄;而Dmrt6抑制Cyp19a1

7、a的轉(zhuǎn)錄且有劑量依賴反應(yīng)。為進(jìn)一步研究Dmrt6在性腺發(fā)育中的作用，采用TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases)技術(shù)對(duì)Dmrt6進(jìn)行了基因敲除。結(jié)果顯示TALEN能高效地對(duì)Dmrt6基因進(jìn)行編輯。與對(duì)照組相比，3月齡Dmrt6敲除個(gè)體精巢中出現(xiàn)了異常，精母細(xì)胞較少，輸精管發(fā)育不正常;免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dmrt6敲除后Cyp11b2與Dmrt1的表達(dá)有所下調(diào)，而Amh與對(duì)照組相比

8、無(wú)明顯差異。
　　 綜上所述，本研究在尼羅羅非魚基因組中分離到7個(gè)DMRT基因，其中Dmrt6為除四足類外首次在真骨魚中發(fā)現(xiàn)，生物信息學(xué)分析表明羅非魚Dmrt6是四足類的同源基因。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)有5個(gè)DMRT基因在性腺中表達(dá)，它們可能在尼羅羅非魚性腺發(fā)育、性別決定與分化中起重要作用。原位雜交與免疫組化表明Dmrt4主要在卵母細(xì)胞中表達(dá)，而Dmrt6主要精母細(xì)胞中表達(dá)，兩者的表達(dá)均與表型相關(guān)。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)Dmrt4可能不參與雌激