結核桿菌感染致腎損傷與IgA腎病發(fā)病相關性研究.pdf

1、目的: IgA腎病(IgAN)為一免疫病理學診斷名稱，腎活檢免疫病理結果為腎小球系膜區(qū)以IgA顆粒樣沉積為主，臨床上以血尿、蛋白尿為主要表現(xiàn)的腎小球腎炎。某些系統(tǒng)性疾病，如過敏性紫癜、肝硬化等也可導致腎小球系膜區(qū)IgA為主的免疫球蛋白沉積，但還沒有系統(tǒng)研究可以證實結核桿菌感染是否能夠導致腎小球系膜區(qū)有IgA為主的免疫球蛋白沉積。結核分枝桿菌(MTB)對腎臟的損傷分為臨床腎結核、病理腎結核、結核性變態(tài)反應綜合征和/或結核性自身免疫

2、性疾病腎損傷。但由于尿培養(yǎng)MTB需要4周，結核菌向尿中排放成間歇性，菌陰結核占結核總數(shù)的70％，所以MTB相關腎臟損傷早期診斷與防治均尚十分薄弱。 本試驗目的是進一步明確腎組織上表達結核分枝桿菌Ag85(MTB-Ag85)在結核桿菌感染致早期腎損傷診斷中的意義，并在已證實有結核桿菌感染患者腎活檢組織中，檢測MTB-Ag85和IgA1，探討二者表達的相關性。 材料和方法: 一、實驗材料 1、實驗標本及分組

3、 本研究所選各組病例均來自2005年至2007年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院患者，平均年齡為42.5±19.5歲。 (1)陽性對照組：泌尿外科住院的臨床腎結核患者外科手術切除腎組織石蠟切片，及其術前24小時尿沉渣，其中6名男患、4名女患，共10例。 (2)陰性對照組：腎內科住院的無結核病史及活動結核灶、PPD或血結核抗體檢驗均為陰性，臨床確診為非IgAN的原發(fā)性腎小球腎炎患者腎組織石蠟切片，及其24小時尿沉渣，其

4、中6名男患、6名女患，共12例。 (3)實驗組：腎內科住院的具有結核病史或活動結核灶、PPD2+或血結核抗體兩次陽性、尿培養(yǎng)或尿沉渣查抗酸桿菌陽性腎病患者的腎活檢組織石蠟切片，及其24小時尿沉渣，其中20名男患、22名女患，共42例。 2、主要試劑和藥品 抗結核分枝桿菌抗原85(MTB-Ag85)、熒光黃標記抗人免疫球蛋白A1(Anti-Human IgA1-FITC)、免疫組化SABC即用試劑盒、DAB顯色試劑

5、盒、生物素化羊抗小鼠IgG1。 3、主要儀器 37℃孵育箱、微波爐、烤片機、光學顯微鏡、熒光顯微鏡、顯微照相儀、顯微圖像分析儀、分光光度計。 二、實驗方法 1、尿培養(yǎng)結核分枝桿菌收集 各組患者24小時尿液，去上清，留20ml沉渣，離心沉淀后，將沉渣加入4％氫氧化鈉溶液消化，無菌操作取上清液，離心后取管底沉渣，加入6％硫酸混勻，將此標本全部接種與固體羅氏培養(yǎng)基斜面，置37℃溫箱培養(yǎng)，每周定時觀察生長

6、情況，如經過2個月培養(yǎng)后仍無細菌生長為陰性結果。若有細菌生長，如生長慢，培養(yǎng)基呈干燥、顆粒狀乳酪色菌落，涂片染色抗酸性強，呈單個散在或索狀排列或成簇成團的桿菌，則為有結核桿菌生長。 2、腎組織形態(tài)學檢查 腎組織標本用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE常規(guī)染色，普通光學顯微鏡觀察。 3、免疫組織化學結果分析 SABC法進行免疫組織化學染色，DAB顯色。顯微照相儀照相，顯微圖像分析儀對圖像定量分析。每張切片隨機

7、選取5個高倍視野(400倍)，測定其陽性染色物質分光密度(Intergrate optical densty,IOD)值。 4、免疫熒光結果分析 直接熒光免疫法檢測各組標本中的IgA1。熒光顯微照相儀照相，顯微圖像分析儀對圖像定量分析。每張切片隨機選取5個高倍視野(400倍)，測定其陽性染色物質平均灰度值。 5、臨床資料分析PPD、與血結核抗體檢測。 6、統(tǒng)計分析方法 計量資料x2檢驗分析各組相關

8、性，SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析處理數(shù)據(jù)，P≤0.05有統(tǒng)計學意義。 結果: 1、尿培養(yǎng)查結核分枝桿菌陽性對照組10例患者尿中3例結核分枝桿菌陽性。陰性對照組患者尿中結核分枝桿菌培養(yǎng)均陰性。實驗組42例患者尿中7例結核分枝桿菌陽性。 2、腎組織病理檢測 (1)實驗組腎活檢病理診斷結果實驗組42例，經該院中心實驗室會診診斷其中有26例為IgAN，8例為非IgA輕中度系膜增生性腎小球腎炎，4例為硬化性腎小

9、球腎炎，2例為輕微病變型腎小球腎炎，2例為膜性腎病。 (2)免疫組織化學檢測MTB-Ag85結果陽性對照組腎組織中MTB-Ag85均為陽性，可見褐色顆粒狀陽性物質沉積在腎間質、腎小管細胞的胞漿及腎小球系膜區(qū)、毛細血管基底膜。 陰性對照組腎組織中1例可見淺褐色物質片狀分布于組織邊緣部分腎間質。 實驗組腎組織中27例可見褐色顆粒狀陽性物質沉積在腎間質、腎小管細胞的胞漿及部分腎小球系膜區(qū)、毛細血管基底膜。腎臟病理損傷嚴

10、重部位陽性物質沉積亦較多。 陽性對照組與實驗組IOD值分別為(36.54±10.06)×103和(33.69±11.82)×103，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義。 (3)免疫熒光檢測IgAl結果陽性對照組均見腎小球系膜區(qū)、毛細血管袢及部分腎小管上皮細胞內可見黃綠色陽性物質顆粒樣沉積。 陰性對照組腎組織中IgAl表達均陰性。 實驗組腎組織切片中，35例腎組織上檢測到IgAl，其中免疫熒光診為IgAN的26例、非

11、IgA系膜增生腎小球腎炎8例、硬化性腎小球腎炎1例，黃綠色陽性物質顆粒樣物質主要沉積于腎小球系膜區(qū)、毛細血管袢及部分腎小管細胞胞漿內；7例腎組織上未檢測到IgAl，其中病理類型為硬化性腎小球腎炎3例、輕微病變型腎小球腎炎2例和膜性腎病2例。 陽性對照組、陰性對照組和實驗組的灰度測定分別為(59.83±4.16)、(10.02±1.38)和(57.94±4.08)，陽性對照組與實驗組的平均灰度值比較無統(tǒng)計學差異；陰性對照組與陽性對

12、照組或實驗組的平均灰度值比較均有統(tǒng)計學差異。 3、實驗組尿培養(yǎng)MTB、PPD檢測、血結核抗體檢測三種常用結核診斷方法與MTB-Ag85檢測結果的相關性分析 實驗組MTB-Ag85的陽性表達與尿培養(yǎng)結果之間在統(tǒng)計學上有關聯(lián)性，其關聯(lián)系數(shù)C值為0.548；與PPD檢測結果之間在統(tǒng)計學上有關聯(lián)性，其關聯(lián)系數(shù)C值為0.323；與血結核抗體檢測結果之間在統(tǒng)計學上有關聯(lián)性，其關聯(lián)系數(shù)C值為0.298。 結論： 1、腎