頸椎舒顆粒對大鼠退變頸椎間盤中MMP-3和TGF-β1的影響.pdf

1、目的與意義:頸椎病泛指頸段脊柱病變后所表現(xiàn)的臨床癥狀和體征。目前國際上較一致的看法是指頸椎間盤退行性變,及其繼發(fā)性椎間關(guān)節(jié)退行性變所致脊髓、神經(jīng)、血管損壞而表現(xiàn)的相應(yīng)癥狀和體征。頸椎病的常見癥狀有頸痛、頭暈、四肢麻木無力,嚴(yán)重的可以合并大小便障礙。
　　 頸椎病是中老年人的常見病、多發(fā)病之一。2010年福州市調(diào)查顯示中青年伏案工作者中頸椎病患者占19.22％,頸椎病亞健康狀態(tài)者占28.86％。長時間的伏案工作及使用電腦、駕車、高

2、枕、睡軟床等諸多因素,使人長時間保持單一姿勢,肌肉韌帶疲勞,從而加速了頸、腰椎疾病的發(fā)生。同時,飲食結(jié)構(gòu)的改變及體重增加,也會加劇疾病的發(fā)生。因此對頸椎病的治療任重而道遠(yuǎn)。
　　 頸椎病至今無理想的治療方法。理療、消炎止痛、頸托支持是現(xiàn)代治療頸椎病的常用措施,外科治療則以脊椎融合術(shù)為主；此外,同種異體髓核組織移植的動物試驗、人工椎間盤置換技術(shù)也在探索之中。非甾體激素治療頸椎病療效不確切,胃腸反應(yīng)重；手術(shù)治療風(fēng)險大、經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重,患

3、者較難接受,并且存在復(fù)發(fā)的可能。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療本病顯示出獨特的優(yōu)勢,中醫(yī)藥治療頸椎病歷史久遠(yuǎn),療效確切,為頸椎病的治療作出了不可磨滅的貢獻(xiàn),特別是近年來中醫(yī)藥在治療頸椎病方面獲得了長足的發(fā)展,多種復(fù)方具有較好的抗頸椎病作用,且療效穩(wěn)定、價格便宜。中醫(yī)藥治療頸椎病的作用機理研究,局限在微循環(huán)、血流動力學(xué)、氧自由基、炎癥介質(zhì)、免疫等領(lǐng)域,而有關(guān)通過運用中醫(yī)藥抑制頸椎間盤退變阻斷頸椎病發(fā)生、發(fā)展的研究卻很少。通過研究中藥復(fù)方對頸椎病的作用,初

4、步探討中藥復(fù)方治療頸椎病的機制。
　　 椎間盤退變的機制較為復(fù)雜,目前研究認(rèn)為椎間盤退變主要表現(xiàn)在細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化,而后者是椎間盤力學(xué)特性喪失的直接原因,正常情況下,椎問盤細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)處于合成代謝與分解代謝的平衡之中,這一平衡的破壞造成髓核水分及其固有彈性的喪失,導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)功能的減退,從而出現(xiàn)椎間盤退變。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3),又稱基質(zhì)溶解酶-1,它在細(xì)胞外基質(zhì)的降解中起關(guān)鍵的

5、作用。它不僅能降解蛋白多糖和糖蛋白,還能裂解多種類型的膠原。此外,它還能激活其他非活性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)而對軟骨基質(zhì)的降解發(fā)揮間接作用。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是一種細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子,具有細(xì)胞趨化、軟骨誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)軟骨中ECM合成等作用。TGF-β1具有多重生物學(xué)效應(yīng),是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖和向成軟骨方向定向分化的主要生長因子之一,可抑制多種炎癥介質(zhì)的生物學(xué)活性,使同種異體細(xì)胞移植更為安

6、全；可促進(jìn)蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成。
　　 利用動物模型復(fù)制疾病是研究和探討疾病病因病機的重要方法,骨骼和韌帶維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定和平衡的作用稱為靜力平衡,肌肉維持該作用稱為動力平衡,頸部正常的生理運動及其穩(wěn)定性總是在靜力平衡的基礎(chǔ)上,依靠肌肉的作用來隨時調(diào)整以達(dá)到動力平衡完成的。通過破壞大鼠頸椎動靜力平衡系統(tǒng)就可以制成動靜力平衡失調(diào)的大鼠頸椎病模型。
　　 綜上所述,椎間盤的退變和椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解密切相關(guān),而T

7、GF-β1可以促進(jìn)ECM的合成；MMP-3可以促進(jìn)ECM的降解?；谇捌诘膶嶒灱芭R床研究,選用頸椎舒顆粒治療大鼠頸椎間盤退變,通過比較各組間椎間盤中TGF-β1和MMP-3含量的差異,來初步探討頸椎舒顆粒對頸椎間盤退變的作用途徑。
　　 方法與內(nèi)容
　　 1.大鼠頸椎間盤退變模型造模選擇3個月齡SPF級SD大鼠,雄性140只,體重(300±20)g左右,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,將其分成手術(shù)組大鼠124只,假手術(shù)中16只。將所有

8、大鼠用10％水合氯醛按3.5ml·kg-1體重腹腔內(nèi)注射,麻醉成功后,頸后部剪毛,碘伏消毒,無菌操作。取頸背部正中縱向切口,長約2～2.5cm,切開皮膚后,充分游離各層肌肉,橫向切斷深群頸夾肌和頭、頸、寰最長肌,完全切除頸髂肋肌與頭半棘肌,然后再依次切斷C2～C7棘上和棘間韌帶,徹底止血后縫合皮膚。16只假手術(shù)的正常大鼠,在頸后部正中作一長約2～2.5cm的切口,止血后縫合。術(shù)后3天給予青霉素肌注,8萬μ/天?？p線自行脫落,術(shù)后放至籠中

9、,任其自由活動。12周后造模完成。
　　 2.動物分組:12周后成模,假手術(shù)中16只全部造模成功。手術(shù)組在手術(shù)中及術(shù)后共死亡14只,隨機抽取80只分成5組分別為:頸椎舒顆粒低劑量組(C組)、中劑量組(D組)、高劑量組(E組),頸復(fù)康顆粒組(F組),模型組(B組),每組16只。16只假手術(shù)組(A組)無死亡。共6組。
　　 3.灌胃治療:按照實驗動物學(xué)藥劑換算方法,計算各組藥物的大鼠灌胃量:大鼠的每日藥量(中劑量g·kg-1

10、·d-1)=標(biāo)準(zhǔn)體重人(60kg)的每日劑量×0.018×5。頸椎舒顆粒的低、中、高劑量分別設(shè)置為0.7g·kg-1·d-1、1.4g·kg-1·d-1、2.8 g·kg-1·d-1。頸復(fù)康顆粒的劑量定位0.7 g·kg-1·d-1。模型組和假手術(shù)組給予等容積生理鹽水。
　　 4.標(biāo)本取材及制備:分別在用藥4周及用藥8周后用急性失血法處死大鼠,立即取大鼠整段頸椎,范圍自枕骨基底部到第二胸椎,每只大鼠的C5-6椎間盤及相鄰椎體分別

11、放在10％福爾馬林溶液固定,進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測,觀察其退變情況。各大鼠的C6-7在4倍手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨終板與椎體的交界面切下椎間盤,用生理鹽水洗去血污,椎間盤組織各20mg加入0.5ml磷酸鹽緩沖液(PH7.4),組織放入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?用于ELISA法檢測。
　　 5.切片觀察:用于光鏡觀察的標(biāo)本在10％中性甲醛固定,15％EDTA脫鈣2周,正中矢狀位切開頸椎,用酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟塊包埋,切片機切片,

12、蘇木素一伊紅染色,顯微鏡下觀察,據(jù)髓核、纖維環(huán)、終板及椎體退變情況。按照Miyamoto等的分級標(biāo)準(zhǔn)對椎間盤評分。
　　 1級:正常椎間盤,纖維環(huán)與髓核排列規(guī)則,軟骨終板分為生長軟骨和關(guān)節(jié)軟骨層,潮標(biāo)清晰。
　　 2級:纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)消失,軟骨終板增生。
　　 3級:髓核皺縮或消失。
　　 4級:纖維環(huán)有裂隙。
　　 5級:椎間盤突出或骨贅形成。
　　 6.ELISA法檢測TGF-β1和M

13、MP-3含量步驟嚴(yán)格按各個試劑盒說明書進(jìn)行。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)方法各組頸椎間盤退變程度比較采用秩和檢驗,數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 各組頸椎間盤中TGF-β1和MMP-3含量的比較均析因設(shè)計資料的方差分析,數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行,各組大鼠治療4周和8周的變化比較采用兩獨立樣本t檢驗(Two Independent-Samples t Test)進(jìn)

14、行統(tǒng)計分析,不同用藥組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計分析,方差齊時多重比較采用LSD-t法檢驗；方差不齊時,用近似方差分析的Welch法,多重比較采用Dunnett T3法檢驗。
　　 結(jié)果
　　 1.各組頸椎間盤退變程度切除鼠頸后部淺、中層肌肉等,破壞鼠頸部動靜力平衡,可以造成頸椎間盤退變,模型組(B組)、假手術(shù)組(A組)、頸椎舒低劑量組(C組)、頸椎舒中劑量組(D組)、頸椎舒高劑量組(

15、E組)、頸復(fù)康組(F組)的椎間盤退變程度差異有顯著意義(P<0.05)。模型組(B組)退變顯著,各治療組(C、D、E、F組)次之。
　　 2.各組大鼠椎間盤的ELISA結(jié)果顯示
　　 2.1.各組頸椎間盤的MMP-3的濃度:不同組別大鼠頸椎間盤中MMP-3含量相比較有顯著差異(F=87.517,P=0.000),結(jié)合SNK法多重比較結(jié)果,假手術(shù)組(A組)、頸椎舒低劑量組(C組)、中劑量組(D組)、高劑量組(E組),頸復(fù)康

16、組(F組)中頸椎間盤的MMP-3的濃度均顯著低于模型組(B組)。D、E、F組中MMP-3的濃度均顯著低于C組。D組和F組無顯著差異。兩個不同用藥時間之間有顯著差異(F=6.581,P=0.012),用藥8周組中MMP-3的濃度均顯著低于用藥4周組。
　　 2.2.各組頸椎間盤的TGF-β1的濃度:不同組別相比較有顯著差異(F=87.990,P=0.000),結(jié)合SNK法多重比較結(jié)果,假手術(shù)組(A組)、頸椎舒低劑量組(C組)、中劑

17、量組(D組)、高劑量組(E組),頸復(fù)康組(F組)中頸椎間盤的TGF-β1濃度均顯著高于模型組(B組)。D、E、F組中TGF-β1的濃度均顯著高于C組。兩個不同用藥時間之間無顯著差異(F=0.174,P=0.678),但用藥8周的均數(shù)有高于用藥4周的趨勢。
　　 結(jié)論
　　 1.頸椎舒顆粒、頸復(fù)康顆粒都具有改善頸椎間盤退變的作用。
　　 2.通過破壞動物頸椎動靜力平衡系統(tǒng)可以成功研制出和人類頸椎病發(fā)病因素(長期低頭